亞洲柑橘黃龍病的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法比較研究

張子悅紀(jì) 藝冉 強(qiáng)魏 巍王 宇李 亮蔡 健陳笑蕓

（1.阜陽(yáng)師范大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽阜陽(yáng)236037；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310021；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081）

柑橘黃龍病又稱(chēng)黃枯病、青果病，是柑橘行業(yè)最嚴(yán)重、最具有毀滅性病害之一，是我國(guó)主要植物檢疫對(duì)象。致病菌屬于革蘭氏陰性細(xì)菌的α－變形菌綱韌皮部桿菌屬[1]。據(jù)報(bào)道，該類(lèi)韌皮部桿菌是一種極難培養(yǎng)的細(xì)菌，迄今為止沒(méi)有成功培養(yǎng)的先例[2]，為柑橘黃龍病的有效防治增添了巨大的阻礙。植物一旦感染黃龍病，葉片出現(xiàn)斑駁型黃化，淀粉的積累量是其他逆境脅迫的20倍，果實(shí)呈畸形，果小味酸，嚴(yán)重影響生理營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[3]，使得柑橘品質(zhì)顯著下降。

為了及時(shí)切斷感染源，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步推進(jìn)和加強(qiáng)黃龍病菌的快速檢疫和診斷工作。黃龍病病原菌的檢驗(yàn)主要基于分子生物學(xué)水平，有核酸分子雜交檢疫技術(shù)，基因芯片技術(shù)，常規(guī)PCR、巢式PCR、半巢式PCR、定量PCR檢測(cè)技術(shù)等。

實(shí)時(shí)熒光PCR（qPCR）與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比具有特異性強(qiáng)、敏感度高、重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)，是1996年美國(guó)首次推出的一種核酸檢測(cè)技術(shù)。2004年，廖曉蘭等[4]首創(chuàng)基于柑橘黃龍病病原菌16S rDNA的qPCR檢測(cè)方式，為黃龍病的定量快速檢測(cè)開(kāi)創(chuàng)了先河。2006年，LI等[5]針對(duì)黃龍病病原菌的16S rDNA首次開(kāi)發(fā)了定量、多重、實(shí)時(shí)、熒光PCR反應(yīng)，可同時(shí)檢測(cè)亞洲、非洲、美洲3種黃龍病，可在不到1h的時(shí)間內(nèi)檢測(cè)病原體。2007年，胡浩[6]又利用qPCR探究了柑橘病原菌在宿主體內(nèi)結(jié)構(gòu)的分布情況，得出病原菌會(huì)集中在富含篩管組織的部分，如種皮、橘絡(luò)、葉脈等都是韌皮部桿菌聚集地的結(jié)論。2011年，肖遠(yuǎn)輝等[7]根據(jù)黃龍病病原菌的secE基因的保守序列設(shè)計(jì)引物探針，建立了黃龍病的qPCR鑒定技術(shù)，并對(duì)所建立的方法在田間進(jìn)行實(shí)際檢驗(yàn)，最低檢測(cè)限達(dá)0.01 ng。2014年，高玉霞等[8]將不同基因上設(shè)計(jì)的兩種引物探針進(jìn)行qPCR靈敏度的比較，結(jié)果顯示李文斌設(shè)計(jì)的HLBaspr探針靈敏度高于王浩設(shè)計(jì)的CQULAP探針，證明了HLBaspr探針更加適用于實(shí)際的檢測(cè)。2016年，趙培婭等[9]針對(duì)qPCR兩組探針?lè)ê鸵唤M染料法的引物進(jìn)行靈敏度比較和實(shí)檢，結(jié)果和高玉霞等人的研究結(jié)論一致。

數(shù)字PCR（dPCR）是VOGELSTEIN、KINZLER[10]在1999年提出的一種無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)曲線和對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)樣品就可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量分析的新型技術(shù)。2018年，ZHONG等[11]首次提出應(yīng)用dPCR來(lái)完成對(duì)黃龍病病原菌的檢疫實(shí)驗(yàn)。但是由于其操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，使用儀器也相對(duì)昂貴，之后在黃龍病檢測(cè)方面再無(wú)報(bào)道。

近幾年由于對(duì)植物疫病現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的迫切需要，各種快速檢測(cè)技術(shù)興起。2005年，OKUDA等[12]首次將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）運(yùn)用在黃龍病的快速檢測(cè)上，只需一個(gè)水浴鍋即可完成檢測(cè)過(guò)程。2018年，QIAN等[13]建立了與染料法結(jié)合的重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) （recombinese polymerase amplification，RPA）檢測(cè)黃龍病的現(xiàn)場(chǎng)可視化方法，并且發(fā)明了避免污染的一體化裝置，整個(gè)過(guò)程控制在10 min之內(nèi)，方便快捷。

對(duì)于實(shí)驗(yàn)室的分子檢測(cè)，選擇特異性強(qiáng)、靈敏度高的引物探針?lè)浅Ｖ匾?。為滿(mǎn)足黃龍病大規(guī)?？焖贆z測(cè)的需求，本研究開(kāi)發(fā)比較了6組引物和探針組合，擴(kuò)增片段大多在亞洲黃龍病菌16S rDNA上，該基因長(zhǎng)度約1.5kb，含有高度保守的基因片段[14]，是進(jìn)行檢測(cè)引物開(kāi)發(fā)和設(shè)計(jì)的絕佳片段。將自行設(shè)計(jì)的一對(duì)引物和前人已報(bào)道的引物進(jìn)行特異性、靈敏度的比較，致力于尋找出一對(duì)優(yōu)質(zhì)的引物探針，為柑橘黃龍病的檢疫工作提供參考，使及時(shí)鏟除黃龍病感染源、提升柑橘質(zhì)量及其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)成為可能。

一、材料與方法

（一）試驗(yàn)材料感染柑橘黃龍病的柑橘葉片，陰性對(duì)照采用本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱種植的無(wú)病毒健康柑橘葉片。大腸桿菌DNA、西瓜嗜酸菌DNA、柑橘潰瘍病菌DNA、放線菌DNA、空氣芽孢桿菌DNA。 預(yù) 混 液ddPCR Supermix for Probes和Droplet Generation Oil for Probes購(gòu)自美國(guó)Bio－Rad公司。Premix Ex Taq（Probe qPCR）預(yù)混液購(gòu)自TaKaRa公司。

（二）主要儀器研究采用CFX 96熒光定量PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）進(jìn)行定量PCR分析。采用QX200微滴式數(shù)字PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）進(jìn)行數(shù)字PCR分析。使用Nanodrop核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)Thermo公司）進(jìn)行DNA濃度和純度的檢測(cè)。采用Qubit 2.0 Q32866熒光計(jì)（美國(guó)Thermo公司）進(jìn)行DNA濃度的檢測(cè)。

（三）樣品前處理采摘的柑橘葉片置于內(nèi)存冰塊的保溫泡沫箱中帶入實(shí)驗(yàn)室，去除污垢和腐爛葉片，用蒸餾水清洗，再用巴氏消毒液與蒸餾水1:100的比例混合進(jìn)行清洗，于通風(fēng)處晾干，干燥后保存在－70℃的冰箱中備用。柑橘葉片基因組DNA的提取采用CTAB法，參考王春梅等[15]的方法稍作修改。

（四）引物與探針根據(jù)亞洲柑橘黃龍病病原菌16S rDNA（NCBI登錄號(hào)：MZ050492.1）的序列設(shè)計(jì)引物，加上通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)和國(guó)家及地方標(biāo)準(zhǔn)，總共對(duì)6組引物探針進(jìn)行收集比較（見(jiàn)表1）。CLIB 4組合根據(jù)NCBI登錄號(hào)EU078703序列設(shè)計(jì)。引物探針對(duì)由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行合成。

表1 柑橘黃龍病PCR檢測(cè)所用引物

續(xù)表1

（五）qPCR和dPCR方法以黃龍病癥狀明顯的柑橘葉片提取的DNA為陽(yáng)性模板，用連續(xù)3倍濃度稀釋的方法稀釋10次，用上述6對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用dPCR法為陽(yáng)性模板DNA拷貝數(shù)進(jìn)行定值，可作為qPCR測(cè)定的絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)。此前對(duì)qPCR和dPCR的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序進(jìn)行了優(yōu)化。最終優(yōu)化選擇的qPCR反應(yīng)擴(kuò)增的總體系為25μL，包含2×qPCR Mix 12.5μL、上下游引物各1μL（終濃度為0.4μmol/L）、探針0.5μL（終濃度為0.2μmol/L）、ddH2O8μL、模板DNA 2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃5 min，95℃15 s， 56℃1 min，共40個(gè)循環(huán)。最后在CFX 96熒光定量PCR儀上讀取Ct值，每組3個(gè)重復(fù)。

總dPCR反應(yīng)體積為20μL，包含2×ddPCR supermix 10μL、上下游引物各1μL（終濃度為0.5μmol/L）、探針0.5 L（終濃度為0.25μmol/L），ddH2O 5.5μL、模板DNA 2μL。反應(yīng)步驟：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，一共44個(gè)循環(huán)，最后98℃持續(xù)10 min使酶滅活。反應(yīng)結(jié)束之后，移到QX200微滴分析儀上對(duì)微滴進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組4個(gè)重復(fù)。

二、結(jié)果

（一）特異性檢測(cè)將提取的柑橘DNA、大腸桿菌DNA、西瓜嗜酸菌DNA、柑橘潰瘍病菌DNA、放線菌DNA、空氣芽孢桿菌DNA分別采用 引 物CLIB 4、CLIB 9、CLIB 11、CLIB 12、Las、rpll進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。如圖1所示，6對(duì)引物在陽(yáng)性柑橘DNA樣品中都有明顯的擴(kuò)增曲線，且Ct值在25左右，其他供試菌均沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生。說(shuō)明6對(duì)引物特異性良好，都可用于黃龍病菌的實(shí)際檢測(cè)。

圖1 6對(duì)引物特異性檢測(cè)結(jié)果

（二）采用dPCR對(duì)各稀釋倍數(shù)樣品定值將提取的DNA陽(yáng)性模板用連續(xù)3倍濃度稀釋的方法稀釋10次，得到1、3、9、27、81、243、729、2 187、6 561、19 683稀釋倍數(shù)的陽(yáng)性模板DNA。采用dPCR進(jìn)行各個(gè)樣品定值，分別為20 295、7 056.25、2 230、736.25、259.5、91.25、41.75、16.25、9.5、4.8拷貝。

（三）低樣本量qPCR檢測(cè)結(jié)果比較選擇81倍稀釋和243倍稀釋的低濃度陽(yáng)性DNA模板用上述6對(duì)引物進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，旨在證明對(duì)于存在少量病原菌的情況下哪一對(duì)引物的檢測(cè)效果更好，能夠更早檢驗(yàn)出該病菌（結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3）。由圖2、圖3可以看出，在81倍稀釋下和243倍稀釋下的同濃度的模板DNA采用引物CLIB 4和引物rpll的起峰值明顯晚于其他引物，表明在檢測(cè)低濃度的樣品時(shí)引物CLIB 4和引物rpll的靈敏度稍差于其他引物。圖4顯示在81倍稀釋下3次重復(fù)的平均Ct值，Las

圖2 81倍稀釋下各引物在檢測(cè)中的擴(kuò)增曲線

圖3 243倍稀釋下各引物在檢測(cè)中的擴(kuò)增曲線

圖4 81倍稀釋下各引物在檢測(cè)中的Ct值

圖5 243倍稀釋下各引物在檢測(cè)中的Ct值

（四）qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢測(cè)限比較將提取的DNA陽(yáng)性模板用連續(xù)3倍濃度稀釋的方法稀釋10次，得到1、3、9、27、81、243、729、2 187、6 561、19 683稀釋倍數(shù)的陽(yáng)性模板DNA。采用CLIB 9、Las、CLIB 11這3對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增以判斷引物靈敏度的高低，結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明，CLIB 9在稀釋得到的10個(gè)陽(yáng)性樣品模板中，有9個(gè)明顯的擴(kuò)增曲線，隨著稀釋倍數(shù)的增加，樣品濃度不斷降低，Ct值不斷升高，其中稀釋6 561倍的DNA樣品平均Ct值達(dá)到38.61，在高于6 561倍稀釋的qPCR中無(wú)法檢驗(yàn)出熒光擴(kuò)增曲線。參考GB/T 28062－2011，Ct值≤35為陽(yáng)性樣品，Ct值＞35為陰性樣品[17]。對(duì)于較低濃度的樣品Ct值較高則不能準(zhǔn)確判斷是否感染黃龍病，需要進(jìn)行進(jìn)一步的檢測(cè)。引物L(fēng)as在稀釋得到的10個(gè)陽(yáng)性樣品模板中均可得到擴(kuò)增曲線，其中稀釋6 561倍的DNA陽(yáng)性模板樣品平均Ct值為37.89，稀釋19 683倍的DNA陽(yáng)性模板樣品平均Ct值為38.39。引物CLIB 11在稀釋得到的10個(gè)陽(yáng)性樣品模板中可得到9個(gè)擴(kuò)增曲線，其中稀釋6 561倍的DNA陽(yáng)性模板樣品平均Ct值達(dá)到37.96，稀釋倍數(shù)高于6 561的沒(méi)有熒光擴(kuò)增曲線。初步判斷這3組引物的靈敏度Las>CLIB 11=CLIB 9，Las的檢測(cè)靈敏度比CLIB 11、CLIB 9高出3倍。擴(kuò)增效率方面CLIB 9為98.9%，Las為101.7%，CLIB 11略低，為97.3%，都在90%～110%之間，表明擴(kuò)增效率較為理想。且3對(duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)R2為0.999（＞0.98），表示qPCR的擴(kuò)增線性關(guān)系良好。

圖6 3種引物qPCR在柑橘黃龍病菌檢測(cè)的靈敏度和標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)試

進(jìn)一步做檢測(cè)限研究，將CLIB 9和CLIB 11在6 561倍的稀釋濃度下設(shè)置8個(gè)重復(fù)，Las在19 683倍的稀釋濃度下設(shè)置8個(gè)重復(fù)，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，在6 561倍稀釋下引物CLIB 9和CLIB 11所設(shè)置的8個(gè)平行反應(yīng)都有熒光信號(hào)，Ct平均值分別為37.48和37.77。對(duì)建立的qPCR方法，要求在線性動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)的重復(fù)性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD一般應(yīng)＜25%[18]。CLIB 9和CLIB 11 8次的檢測(cè)結(jié)果RSD分別是0.23%和3.86%，都＜25%，因此該兩種方法的檢測(cè)限為9.5拷貝。在19 683倍稀釋濃度下引物L(fēng)as的8個(gè)平行反應(yīng)都存在熒光信號(hào)，平均Ct值為38.58，RSD為2.91%（＜25%）。因此由實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的驗(yàn)證估測(cè)引物L(fēng)as的檢測(cè)限為4.8拷貝。即靈敏度Las>CLIB 11＝CLIB 9，引物L(fēng)as相對(duì)于其他引物對(duì)，可以檢測(cè)出更加微量感染黃龍病的柑橘基因組DNA，能用于黃龍病菌的早期檢驗(yàn)。

表2 3組引物的檢出限研究

（五）dPCR檢測(cè)微滴范圍介于正負(fù)液滴之間的熒光單位被稱(chēng)為“雨滴現(xiàn)象”，正、負(fù)液滴之間的區(qū)別越明顯，閾值位置對(duì)其拷貝數(shù)的影響就越小，越接近真值。降雨通常是由于PCR延遲出現(xiàn)，或個(gè)別微滴的部分PCR被抑制所導(dǎo)致[19]。將陽(yáng)性模板DNA用CLIB 9、Las、CLIB 11 3對(duì)引物進(jìn)行dPCR擴(kuò)增，在dPCR的反應(yīng)熱圖（見(jiàn)圖7）中，引物對(duì)CLIB 9與Las、CLIB 11的反應(yīng)微滴熒光強(qiáng)度存在顯著的差異，CLIB 9在反應(yīng)過(guò)程中沒(méi)有將陽(yáng)性信號(hào)微滴與陰性信號(hào)微滴明顯區(qū)分開(kāi)， “雨滴現(xiàn)象”嚴(yán)重，表明此引物探針在dPCR反應(yīng)中不適用。Las、CLIB 11反應(yīng)熱圖中陽(yáng)性信號(hào)微滴與陰性信號(hào)微滴很好地區(qū)分開(kāi)，并且沒(méi)有明顯的“下雨”現(xiàn)象，且相比之下CLIB 11略好一些，表明這兩條引物對(duì)都可用于dPCR檢測(cè)。CLIB 9檢測(cè)出的陽(yáng)性微滴拷貝數(shù)顯著低于其他兩對(duì)，Las、CLIB 11檢測(cè)到的陽(yáng)性微滴的拷貝數(shù)相對(duì)穩(wěn)定，這可能與所設(shè)計(jì)的引物探針組合所在基因位置存在差異有關(guān)。

圖7 3種引物dPCR測(cè)試

三、討論與結(jié)論

黃龍病病原菌是我國(guó)柑橘行業(yè)發(fā)展的頭號(hào)威脅者，其對(duì)柑橘的生長(zhǎng)和營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)造成嚴(yán)重的損害，使果實(shí)可食率降低，維生素C、類(lèi)胡蘿卜素和類(lèi)黃酮等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不同程度流失，柑橘口感風(fēng)味喪失[20]，無(wú)論在生態(tài)環(huán)境還是經(jīng)濟(jì)上都造成巨大損失。本文主要針對(duì)16S rDNA保守性極強(qiáng)的基因序列，比較6種定量PCR引物在qPCR中的檢測(cè)限和在dPCR中的適用性。2007年，丁芳等[21]進(jìn)行過(guò)定性引物靈敏度比較實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示P400F/P400R>P535F/P535R>f A2/r J5>OI1/OI2c>f OI2/r23S1。2015年，高玉霞[22]對(duì)傳統(tǒng)PCR檢測(cè)黃龍病的6對(duì)引物進(jìn)行靈敏度的比較，得出Las606/LSS>16S>P400>OI1/OI2c＝P535＝A2J5。2019年，肖婉鈺和黃江華[23]比較了定性引物的靈敏度，得出OI1/OI2c>P3/P4>P1/P2。以上都證明在柑橘黃龍病菌的16S rDNA基因上設(shè)計(jì)的引物具有高度的特異性、保守性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。本研究在對(duì)其中都處于16S rDNA序列位置的3對(duì)熒光定量PCR引物的靈敏度進(jìn)行比較，得出Las>CLIB 11＝CLIB 9，引物L(fēng)as可檢測(cè)到僅4.8拷貝的黃龍病病原菌，檢測(cè)效果最好。dPCR也顯示引物L(fēng)as和CLIB 11可以很好地將陽(yáng)性微滴和陰性微滴區(qū)分開(kāi)來(lái)，同時(shí)也可作為dPCR引物探針使用，這與ZHONG等[11]的研究結(jié)果一致。同時(shí)研究也證明引物的靈敏度和擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度有著很大的關(guān)系，擴(kuò)增片段越小，靈敏度越大[24]，建議在柑橘黃龍病菌檢測(cè)引物的設(shè)計(jì)和選擇上采用16S rDNA上的擴(kuò)增較短序列進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。dPCR雖然可以精確捕捉到超低微量的黃龍病病原菌，為幫助技術(shù)人員判斷黃龍病的早期感染提供積極有效的方法，但此技術(shù)在我國(guó)并未進(jìn)行大規(guī)模的推廣應(yīng)用。原因可能是此方法需要昂貴的儀器，且操作相對(duì)復(fù)雜[25]。最新研究顯示，抑菌泛素寡核苷酸（antibacterial FANA oligonucleotides）被證明是治療黃龍病的一種新方法，是一種類(lèi)似于轉(zhuǎn)錄后的RNA沉默技術(shù)，可以通過(guò)作用于減少黃龍病病原菌的共生菌體從而達(dá)到減少黃龍病病原菌的效果，最終降低黃龍病病菌的傳播[26]，可以在一定程度上減緩黃龍病病原菌對(duì)藥物的耐受性。建議未來(lái)可同時(shí)將殺蟲(chóng)劑、清除受感染的樹(shù)木、通過(guò)RNA干擾控制基因表達(dá)、基因編輯等多種方法工具結(jié)合，納入黃龍病綜合控制管理的計(jì)劃范圍之內(nèi)，并且同時(shí)發(fā)展高質(zhì)量的一體化可用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)技術(shù)，為更好地防控黃龍病，從而提升柑橘品質(zhì)及其食用安全建立起更高效的技術(shù)平臺(tái)。