超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定蜂蜜中的多類植物毒素

張 帥 孟 娟 張 晶 許 莉 劉先軍 邵 兵

（1.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100013；2.北京微量化學(xué)研究所，北京100091；3.國(guó)際關(guān)系學(xué)院，北京100091）

蜂蜜是一種深受消費(fèi)者喜愛(ài)的藥食同源產(chǎn)品。隨著人們健康保健意識(shí)的不斷提高，其需求量逐年增長(zhǎng)，進(jìn)口數(shù)量也呈現(xiàn)明顯遞增趨勢(shì)[1]，與此同時(shí)，蜂蜜的安全性也受到了廣泛重視[2]。然而，以往的研究多集中于蜂蜜的農(nóng)獸藥殘留[3]或者外源性的摻假方面，對(duì)內(nèi)源性的污染關(guān)注相對(duì)較少。由于蜜蜂可在蜂巢周邊平均7 km2范圍內(nèi)采集多種植物的花蜜[4]，因此極有可能同時(shí)暴露在多類有毒生物堿下，如雷公藤類和吡咯里西啶類生物堿。雷公藤類化合物主要來(lái)源于衛(wèi)矛科雷公藤屬植物，主要用于治療自身免疫性疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[5～6]和系統(tǒng)性紅斑狼瘡[7]。大部分雷公藤中的萜類化合物除有一定的治療作用外，還對(duì)腎臟[8]和肝臟[9]有嚴(yán)重的毒副作用，在臨床上其毒副作用發(fā)生率接近60%[10]；近年來(lái)常有因食用含有雷公藤類生物堿的蜂蜜而中毒甚至死亡的報(bào)道[11～12]。吡咯里西啶類生物堿（Pyrrolizidine alkaloids，PAs）在大自然中廣泛存在，KEMPF等[13]總結(jié)了蜂蜜和花粉中PAs的基本情況，SCHRAMM等[14]綜述了植物中的PAs的生物合成路徑、毒性和存在情況。德國(guó)聯(lián)邦風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究所（BfR）指出，PAs不僅會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的肝損傷，還具有遺傳毒性[15]。此外，倍半萜內(nèi)酯類化合物馬桑寧[16]和羥基馬桑毒內(nèi)酯[17]也都有一定的毒性；異喹啉類化合物小檗堿雖然毒性較低，卻可導(dǎo)致新生兒和胎兒核黃疸或加重[18]。鑒于這些植物毒素可能在蜜源地同時(shí)存在，可能會(huì)帶來(lái)潛在的健康風(fēng)險(xiǎn)，需要建立相應(yīng)的便捷、快速、靈敏的檢測(cè)方法。

現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道蜂蜜中植物毒素的檢測(cè)方法主要有液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜[19]、氣相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜[20]和液相色譜－四級(jí)桿－飛行時(shí)間質(zhì)譜[21～22]。其中液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜已被證明是定量分析各種殘留物和污染物的有力工具[23～24]，可用于蜂蜜中多種植物毒素的同時(shí)準(zhǔn)確定性和定量分析。在復(fù)雜基質(zhì)中化合物的準(zhǔn)確定量會(huì)受到嚴(yán)重影響，而樣品的凈化方法也會(huì)對(duì)靈敏度和準(zhǔn)確性造成一定影響。目前蜂蜜樣品凈化方法多是固相微萃取[20]和QuEChERS[21～22]技術(shù)。鑒于被測(cè)定的多種化合物極性差別較大，固相微萃取不能同時(shí)滿足對(duì)這些化合物基質(zhì)去除效果和回收率要求，本文選擇了操作簡(jiǎn)便、省時(shí)的QuEChERS凈化方法，結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC－MS/MS）建立了同時(shí)對(duì)蜂蜜中多種植物毒素的定量分析方法。

一、材料與方法

（一）儀器超高效液相色譜－Xevo TQ－S三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國(guó)沃特世公司）；AL204型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器公司）；Allegra X－22R多功能臺(tái)式高速離心機(jī)（美國(guó)貝克曼公司）。

（二）試劑與樣品甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)霍尼韋爾國(guó)際公司）；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；硫酸鎂、甲酸（分析純，百靈威科技有限公司）；N－丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）（美國(guó)默克公司）。

馬桑寧、雷公藤吉堿、雷公藤次堿、雷公藤定堿、雷公藤春堿、雷酚內(nèi)酯、雷公藤內(nèi)酯酮、雷公藤甲素、蘭薊定、克氏千里光寧、倒千里光堿、千里光寧、野百合堿、千里光菲林、小檗堿、荷葉堿、石松胺、羥基馬桑毒內(nèi)酯（純度≥98%，北京索萊寶科技有限公司）。

蜂蜜樣品92種，購(gòu)自大型超市、零售店及網(wǎng)上商城，其中2種產(chǎn)自浙江（紫云英蜜和雜花蜜各1種）、3種產(chǎn)自新疆（1種枸杞蜜和2種黑蜂蜜）、3種產(chǎn)自上海（紫云英蜜、洋槐蜜和雜花蜜各1種）、7種是產(chǎn)自河北的洋槐蜜、9種產(chǎn)自北京（7種洋槐蜜、1種荊花蜜和1種棗花蜜）、11種產(chǎn)自遼寧（3種洋槐蜜、3種椴樹蜜、3種黑蜂蜜和2種雜花蜜）、21種是產(chǎn)自山東的洋槐蜜、22種是產(chǎn)自陜西的油菜花蜜、9種是產(chǎn)自新西蘭的麥盧卡蜂蜜、5種產(chǎn)地不明（3種洋槐蜜和2種棗花蜜）。

（三）實(shí)驗(yàn)方法

1.樣品前處理。稱取1 g蜂蜜樣品于10 mL離心管中，用1 mL超純水溶解后，加入6 mL乙腈，渦旋1 min。之后加入1.0 g NaCl，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min。吸取4 mL上清液于含50 mg PSA的凈化管中，渦旋1 min，5 000 r/min離心10 min。準(zhǔn)確吸取3 mL上清液，在適當(dāng)?shù)牡獨(dú)饬飨麓蹈?，?00μL甲醇溶解，再用0.1%甲酸水溶液定容至1 mL，供UPLC－MS/MS測(cè)定。

2.儀器條件。（1）色譜條件。色譜柱：BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7μm）；流動(dòng)相：A相為甲醇，B相為0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫程序：0～3 min，10%～15%A；3～5 min，15%～25%A；5～5.5 min，25%A；5.5～7 min，25%～62%A；7～10 min，62%～100%A；10～12 min，100%A；12～12.1 min，100%～10%A；12.1～14 min，10%A；柱溫：40℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI+）；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）；干燥氣：氮?dú)?；離子源溫度為150℃；脫溶劑氣流速為800 L/h；脫溶劑氣溫度為400℃；碰撞氣流速為0.14 mL/min；毛細(xì)管電壓為2.5 kV；錐孔電壓為35 V。目標(biāo)物相應(yīng)的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子對(duì)（m/z）和碰撞能量等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 18種植物毒素的MRM模式優(yōu)化參數(shù)

二、結(jié)果與分析

（一）色譜條件的優(yōu)化由于18種目標(biāo)植物毒素易溶于甲醇和乙腈，因此選擇了反相色譜柱和反相色譜常用的流動(dòng)相體系甲醇－水和乙腈－水進(jìn)行考察。本文對(duì)18種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜檢測(cè)均采用正離子模式，甲酸的存在有助于促進(jìn)其離子化，形成[M+H]+，從而提高分析的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)主要對(duì)比了甲醇－0.1%甲酸水溶液和乙腈－0.1%甲酸水溶液對(duì)各待測(cè)物的分析效果，結(jié)果表明，甲醇－0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相時(shí)可獲得較好的響應(yīng)值和分離度。18種植物毒素在兩種分離體系下的總離子流圖如圖1所示。

圖1 18種植物毒素在不同分離體系下的總離子流圖

（二）加水量的優(yōu)化由于蜂蜜中含水量很少，當(dāng)用QuEChERS方法提取時(shí)，如直接加入有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，會(huì)因分散性不佳、黏合共沉淀等原因而降低提取效率，因此需要先加入一定量的水把蜂蜜溶解。本文考察了加水量對(duì)目標(biāo)物回收率的影響，結(jié)果如圖2所示，用0.5 mL水溶解1 g蜂蜜時(shí)，多個(gè)化合物的回收率都比較低；當(dāng)加入的水多于1 mL時(shí)，野百合堿、石松胺和倒千里光堿的回收率隨水體積的增加而下降；用1 mL水溶解時(shí)，大多數(shù)生物堿可得到理想的回收率，因此本文最終選擇用1 mL水溶解1 g蜂蜜。

圖2 加水量對(duì)回收率的影響

（三）鹽析劑的優(yōu)化MARTINELLO等[22]和TANNER及CZERWENKA[25]在測(cè)定蜂蜜中吡咯里西啶生物堿時(shí)所使用的鹽析試劑為無(wú)水MgSO4、NaCl、二水合檸檬酸三鈉和一水合檸檬酸二鈉的混合物，與市售的鹽析試劑配方基本一致。由于QuEChERS前處理過(guò)程中加入的鹽析試劑主要是使有機(jī)相和水相分層，因此考慮盡可能地簡(jiǎn)化鹽析試劑的組成，進(jìn)而比較了上述組合的鹽析試劑（1 g無(wú)水MgSO4、0.5 g NaCl、0.5 g二水合檸檬酸三鈉和0.25 g一水合檸檬酸二鈉）和1.0 g NaCl的鹽析試劑對(duì)回收率的影響。結(jié)果表明，使用混合鹽析劑時(shí)野百合堿、石松胺和倒千里光堿的回收率為88.1%、58.3%和86.3%，稍高于氯化鈉作為鹽析劑的體系，而兩體系對(duì)其他生物堿的回收率幾乎沒(méi)有差異。因此，從操作簡(jiǎn)便和降低成本方面考慮，選擇NaCl作為鹽析試劑。

（四）吸附劑的選擇QuEChERS凈化過(guò)程中，最常用的吸附劑包括C18和PSA，其中前者對(duì)非極性組分具有很強(qiáng)的吸附性，后者可有效去除甲酸、脂肪酸、極性色素等雜質(zhì)。MARTINELLO等[22]和TANNER及CZERWENKA[25]在測(cè)定蜂蜜中吡咯里西啶生物堿時(shí)使用了氨基填料，因此，本研究將凈化填料總量設(shè)為50 mg，比較了C18、PSA和C18與PSA不同比例組合時(shí)對(duì)18種植物毒素的凈化效果和回收率的影響。結(jié)果表明，不同比例的C18和PSA并沒(méi)有對(duì)回收率產(chǎn)生明顯影響，但隨著PSA比例的降低，蘭薊定、克氏千里光寧、小檗堿、雷公藤甲素、雷公藤內(nèi)酯酮和雷酚內(nèi)酯的基質(zhì)抑制作用明顯增強(qiáng)（見(jiàn)圖3），推測(cè)與PSA的結(jié)構(gòu)和吸附性能有關(guān)。PSA為N－丙基乙二胺，屬于胺基類吸附劑，對(duì)有機(jī)酸、色素、糖類等極性物質(zhì)的去除效率較高。當(dāng)吸附劑中PSA的比例增高時(shí)，提取液中的糖類等雜質(zhì)的去除效果更好，從而改善了基質(zhì)抑制。因此，從降低基質(zhì)效應(yīng)的角度考慮，本研究選擇的凈化材料為50 mg PSA。

圖3 不同比例C18和PSA組合對(duì)目標(biāo)物基質(zhì)效應(yīng)的影響

（五）方法的線性范圍、檢出限和定量限采用未檢出目標(biāo)化合物的蜂蜜樣品所配制成的不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，對(duì)本試驗(yàn)的方法學(xué)參數(shù)進(jìn)行考察。以目標(biāo)化合物的峰面積（y）對(duì)應(yīng)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（x，μg/L）繪制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信噪比（S/N≥3）確定方法檢出限（LOD）；以信噪比（S/N≥10）確定方法定量下限（LLOQ）。18種目標(biāo)物質(zhì)的線性范圍見(jiàn)表2，從結(jié)果可得，18種植物毒素在給定的濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（R2）均＞0.99。

表2 18種植物毒素的方法線性范圍、檢出限和定量下限

（六）方法的回收率與精密度本研究對(duì)低、中、高3個(gè)加標(biāo)濃度水平的蜂蜜樣品進(jìn)行分析，考察方法在實(shí)際樣品分析中的可靠性與穩(wěn)定性。結(jié)果如表3所示，3個(gè)加標(biāo)水平的實(shí)際蜂蜜樣品中，除石松胺的回收率在48%～60%之間，其他目標(biāo)化合物的回收率均在70%～112.5%之間，所有化合物的日內(nèi)精密度RSD≤15.1%（n＝6）。結(jié)果表明，該方法具有良好的穩(wěn)定性與重現(xiàn)性，可用于蜂蜜樣品的分析。

表3 18種植物毒素在蜂蜜基質(zhì)中的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （n＝6）

（七）實(shí)際樣品測(cè)定在大型超市、零售店及網(wǎng)上商城購(gòu)買了92種蜂蜜，其中進(jìn)口麥盧卡蜂蜜9種。83種國(guó)產(chǎn)蜂蜜的產(chǎn)地包括北京、上海、山東、河北、新疆等；從蜜源上看，有洋槐蜜、荊花蜜、棗花蜜和油菜花蜜。采用本試驗(yàn)所建立的方法對(duì)這些產(chǎn)品進(jìn)行了檢測(cè)，其中26個(gè)樣品檢測(cè)出了小檗堿，含量為0.2～49.5μg/kg，7個(gè)產(chǎn)自新西蘭的樣品中小檗堿含量在3μg/kg以上，僅1個(gè)產(chǎn)自陜西的樣品中小檗堿含量為49.5μg/kg，其余國(guó)產(chǎn)樣品小檗堿含量均低于1μg/kg；5個(gè)樣品檢測(cè)出了石松胺，3個(gè)樣品為產(chǎn)自新西蘭的樣品、2個(gè)為產(chǎn)自陜西的樣品，含量為5.45～16.6μg/kg；3個(gè)產(chǎn)自新西蘭的產(chǎn)品和1個(gè)產(chǎn)自陜西的產(chǎn)品同時(shí)檢測(cè)出了小檗堿和石松胺；其他16種植物毒素均未檢出。

由于小檗堿廣泛存在于小檗科、罌粟科和毛茛科植物中，且這幾個(gè)科的植物屬種繁多，普遍存在于溫帶和亞熱帶地區(qū)；石松胺是吡咯里西啶類生物堿中非常常見(jiàn)的一種，且主要存在于紫堇科（菊科）、紫草科和夾竹桃科植物中，這幾個(gè)科的植物在世界各地較普遍，在我國(guó)特別是山西、陜西、甘肅等省較多，在澳大利亞、美國(guó)、加拿大、新西蘭等國(guó)也廣泛分布。蜜蜂很容易采集到這幾類植物的花粉或花蜜，這也許是有些蜂蜜中含有小檗堿和石松胺的原因。

三、結(jié)論

本研究利用乙腈提取蜂蜜樣品，用改良的QuEChERS方法凈化，并結(jié)合超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，建立了蜂蜜中吡咯里西啶類、雷公藤類、小檗堿、荷葉堿、馬桑寧和羥基馬桑毒內(nèi)酯等共18種化合物的快速、高靈敏度定量分析方法。該方法具有較高的重現(xiàn)性和精密度，各項(xiàng)指標(biāo)均可達(dá)到蜂蜜中目標(biāo)化合物痕量分析的要求，為蜂蜜中植物毒素的污染監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)支持。