基于高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析技術(shù)的活性菌天然代謝產(chǎn)物研究

袁智鵬 盧國柱 毛 馨 劉慧慧 顏 碩 肖志明 李彥伸

（1.煙臺大學(xué)，山東煙臺264005；2.山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東煙臺264005；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京100081）

高分辨質(zhì)譜是一種先進(jìn)的分析工具，被廣泛用于食品、衛(wèi)生、醫(yī)藥領(lǐng)域[1]。高分辨質(zhì)譜檢測通過獲得待測物的質(zhì)荷比信息對未知成分進(jìn)行更好的檢測和分析[2]。由于其高靈敏度和高分辨率，質(zhì)譜分析經(jīng)常用來表征和鑒定復(fù)雜的有機分子，特別是用于一些存在于復(fù)雜基體中的微量物質(zhì)的檢測和一些非靶向檢測[3]。如今，由于高分辨質(zhì)譜產(chǎn)生了很多高度特異性的鑒定，并且方便于研究人員回顧性分析一些未知物質(zhì)的原始數(shù)據(jù)，高分辨質(zhì)譜在檢測中的使用正變得越來越普遍[4]。

蠟樣芽孢桿菌屬芽孢桿菌科芽孢桿菌屬[5]。其有些菌株與很多同屬的菌株一樣（如枯草芽孢桿菌[6]、短短芽孢桿菌[7]），能夠分泌多種拮抗細(xì)菌、真菌和線蟲的活性物質(zhì)，是預(yù)防植物病害、殺滅致病菌的有效活性菌[8]。比如有研究發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌對番茄灰霉病菌[9]、枇杷果實炭疽病菌[10]、小麥全蝕病菌[11]、玉米穗腐敗病菌[12]、苜蓿腐爛病菌[13]等真菌性病害都有很強的抑制作用。蠟樣芽孢桿菌的抗菌效果，對于長久以來有效抗生素藥物的嚴(yán)重缺乏來說無疑是一個好消息。針對蠟樣芽孢桿菌在新藥研制、抗菌殺菌方面的研究日益增多，并取得了不小的成就。HU等[14]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)燦爛弧菌感染刺參時，其腸道菌群中的蠟樣芽孢桿菌的比例明顯增加，由此發(fā)現(xiàn)了蠟樣芽孢桿菌的強效的抗菌殺菌能力，之后他從日本沼蝦中分離得到一株能夠有效拮抗?fàn)N爛弧菌的蠟樣芽孢桿菌。ESTEFANíA等[15]從植物根際中分離出一株蠟樣芽孢桿菌，可以有效拮抗玉米的主要病原真菌擬輪枝鐮孢菌。從微生物體內(nèi)提取得到可供人類利用的天然產(chǎn)物[16]無疑是近幾年來新型抗生素藥物發(fā)掘的又一個新途徑，但是也面臨一個重要問題，那就是提取和純化工作相對復(fù)雜且成本較高，如果通過數(shù)據(jù)分析來省掉復(fù)雜且成本較高的先純化后檢測工作，直接得到有效物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，那將大大提高新型藥物的研發(fā)效率，同時也對非靶向代謝產(chǎn)物的分析具有重要意義。近幾年由于科技的發(fā)展，大量的數(shù)據(jù)分析逐漸成為研究者實驗工作的必備技能。究其原因，一方面主要是因為實驗儀器的更新使得人們可以獲得更多層面的數(shù)據(jù)。另一方面，通過對相關(guān)數(shù)據(jù)的分析，可以避免一些較為繁瑣復(fù)雜的試驗，僅僅通過數(shù)據(jù)便可以獲得想要的結(jié)果。

數(shù)據(jù)的獲得通過高分辨質(zhì)譜可以實現(xiàn)，但數(shù)據(jù)的分析則需要新的數(shù)據(jù)分析軟件來支持。MZmine是一種用于處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)的開源軟件，主要針對液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC－MS）數(shù)據(jù)的處理，幾乎涵蓋了LC－MS數(shù)據(jù)分析處理的整個流程，可去除大量無用的峰從而得到更有價值的分析結(jié)果，適合大批量的數(shù)據(jù)分析[17]。它的起源是2006年生物信息學(xué)出版物中描述的一個MZmine工具箱，后來經(jīng)過多次重新編寫和設(shè)計[18]，在非靶向代謝組學(xué)分析中具有廣泛的應(yīng)用。全球天然產(chǎn)物社會分子網(wǎng)絡(luò)（Global Natural Products Social Molecular Networking，GNPS）是一個基于網(wǎng)絡(luò)的質(zhì)譜生態(tài)系統(tǒng)，旨在成為一個開放獲取的知識庫，供社區(qū)組織共享、加工和鑒定串聯(lián)質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)[19～20]。GNPS在天然產(chǎn)物研究領(lǐng)域中的影響不亞于Genbank和Basic Local Alignment Search Tool（BLAST）在DNA和RNA序列領(lǐng)域中的影響[21]。

本文旨在建立一種快速確定活性菌特異性天然產(chǎn)物的方法，主要是基于高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析活性菌的代謝產(chǎn)物差異，獲得活性菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的信息。以提取出的活性菌抗菌物質(zhì)作為依托，驗證該方法的可行性。通過對活性菌單獨培養(yǎng)、致病菌單獨培養(yǎng)（選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株作為指示菌）、活性菌和致病菌混合培養(yǎng)3種狀態(tài)的菌株代謝產(chǎn)物進(jìn)行匯總分析和差異比較，經(jīng)組間的差異分析得到活性菌特異性的代謝產(chǎn)物分子信息。將該代謝產(chǎn)物的一二級質(zhì)譜信息與提取得到的抗菌物質(zhì)的一二級質(zhì)譜信息進(jìn)行對應(yīng)，以此對所鑒定的抗菌物質(zhì)進(jìn)行確定，證明通過數(shù)據(jù)處理、差異分析確定活性菌的抗菌物質(zhì)的可行性。

一、材料與方法

（一）材料與試劑所用到的細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株有：大腸桿菌Escherichia coliATCC25922、金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC29213，均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈。

活性菌C2－4、活性菌21－1－1－2，分離自山東煙臺土壤中，均為蠟樣芽孢桿菌，對ATCC25922、ATCC29213均具有抑菌作用。

腦心浸出液（BHI）瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸出液（BHI）肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；乙酸乙酯、甲醇、氯仿、硫酸銨，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

（二）儀器與設(shè)備SW－CJ－2DX型雙人單面超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；D－1－70型自動控制壓力蒸汽滅菌鍋，北京發(fā)恩科貿(mào)有限公司；電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；SHH－250L生化培養(yǎng)箱，重慶永生實驗儀器廠；RE 5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHZ－D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；H2050R醫(yī)用離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；空氣泵－氮吹儀，杭州米歐有限公司；Model12300制備液相色譜，美國SSI公司；QExactive HF組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀，美國Thermo公司。

（三）固體培養(yǎng)基中次級代謝產(chǎn)物的提取方法

1.菌株復(fù)蘇及種子液制備。用一次性接種環(huán)蘸取活性菌和指示菌菌液在BHI固體平板三區(qū)劃線，將平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。用滅菌后的牙簽挑取劃線復(fù)蘇后平板上的單菌落，將其接種在裝有1 mL BHI液體肉湯培養(yǎng)基的2 mL離心管中，置于搖床恒溫培養(yǎng)6～8 h。搖床培養(yǎng)條件為溫度37℃，轉(zhuǎn)速210 r/min。

2.活性菌抗菌活性的驗證。采用雙層瓊脂平板法[22]驗證。用移液槍吸取10μL活性菌菌液點接在BHI固體培養(yǎng)基上，使菌液在平板上形成一個直徑約為1 cm的菌點，倒置培養(yǎng)過夜。向高壓滅菌后還未凝結(jié)的上層肉湯培養(yǎng)基內(nèi)加入指示菌種子液，比例為1∶1 000，搖勻后緩緩倒入已接種活性菌的平板，待上層培養(yǎng)基晾干，將平板倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。次日觀察結(jié)果，出現(xiàn)抑菌圈即證明活性菌具有抗菌活性。

3.待提取平板的制備。（1）單菌培養(yǎng)平板的制備：用移液槍分別吸取活性菌C2－4、活性菌21－1－1－2、ATCC25922、ATCC29213的種子液各200μL，點接在BHI固體培養(yǎng)基上，用無菌棉棒涂抹均勻。在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)3 d。（2）混合培養(yǎng)平板的制備：以活性菌抑菌實驗的雙層瓊脂平板繼續(xù)培養(yǎng)3 d作為混合培養(yǎng)平板。（3）以不接種任何菌種的BHI平板作為空白對照，每個平板設(shè)置3個平行。

4.次級代謝產(chǎn)物的提取。（1）平板打孔：用無菌的1 000μL移液槍槍頭在長滿菌的固體平板上打孔，單菌培養(yǎng)平板和空白平板分別均勻打孔3～5個，混合培養(yǎng)平板在活性菌的抑菌圈范圍內(nèi)打孔3～5個。用無菌牙簽挑取打孔處瓊脂塊分裝至10 mL離心管中，置于4℃條件下避光保存。（2）提取次級代謝產(chǎn)物：向每個含有瓊脂塊的離心管中分別加入4 mL乙酸乙酯并充分渦旋混勻，30℃下超聲30 min。再次充分渦旋混勻后，將離心管在室溫下水浴振蕩30 min。振蕩結(jié)束后，用移液槍將上清液取出并轉(zhuǎn)移至新的10 mL離心管中，繼續(xù)向含有瓊脂塊的離心管中加入4 mL氯仿。重復(fù)上述步驟，將氯仿提取后的上清液與乙酸乙酯提取的上清液合并。合并后的提取液進(jìn)行氮吹至近干。向提取物中加入75%的甲醇復(fù)溶。充分渦旋混勻后將該提取液在4℃下14 000 r/min離心20 min。離心后的上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，再次充分渦旋混勻。將進(jìn)樣小瓶置于－20℃條件下避光保存，以備檢測。

（四）液體培養(yǎng)基中次級代謝產(chǎn)物的提取方法

1.待提取液的制備。（1）單菌培養(yǎng)液的制備：將活性菌C2－4、活性菌21－1－1－2、ATCC25922、ATCC29213的種子液分別按照1‰的比例接種至新的BHI肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，然后置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h。（2）混合培養(yǎng)液的制備：將兩株活性菌與兩株指示菌種子液分別等體積混合，按照1‰的接種量接種至新的BHI肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，置于37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h。（3）以不接種任何菌種的BHI肉湯培養(yǎng)基作為空白對照，且每個培養(yǎng)液設(shè)置3個平行。

2.次級代謝產(chǎn)物的提取。待提取液在恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)20 h時，用移液槍從待提取液中取出100μL菌液，然后加入900μL50%甲醇（先加入450μL甲醇，充分渦旋混勻，后再加入450μL水），充分渦旋混勻。將該提取液在4℃下14 000 r/min離心20 min。離心后的上清液經(jīng)0.45μm濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣小瓶中，再次充分渦旋混勻。將進(jìn)樣小瓶置于－20℃條件下避光保存，以備檢測。

（五）發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的提取與純化方法發(fā)酵液中抗菌物質(zhì)的提取與純化采用有機溶劑萃取法、葡聚糖凝膠層析法、制備型液相層析法[23]。將活性菌種子液按1∶1 000的比例加入高壓滅菌后的BHI肉湯培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)20 h。將培養(yǎng)后的菌液離心，條件為25℃下10 000 r/min離心15 min。取出上清液，倒入1 L的分液漏斗中，加入等量的氯仿，振搖3～5 min，靜置分層。水相有機相分離后，將水相重新轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入等量的氯仿，相同條件下進(jìn)行二次萃取。兩次萃取后的有機相混合后，向其中加入約50 g的硫酸銨吸水，待有機相變得清澈透明后過濾至圓底燒瓶中（濾紙中提前加入適量硫酸銨），用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃、60 r/min條件下蒸發(fā)，至燒瓶內(nèi)剩余1～2 mL時停止旋蒸。用玻璃吸管吸取剩余液體至進(jìn)樣小瓶中（進(jìn)樣小瓶提前稱量），然后使用空氣泵－氮吹儀吹干，同樣稱量。用甲醇復(fù)溶后保存至4℃條件下。使用Sephadex LH－20凝膠對萃取后的粗提物進(jìn)行層析，用甲醇平衡層析柱，流速控制在1.2 mL/min，將粗提物過膜（0.45μm）后加入層析柱，使用甲醇作為洗脫溶劑，調(diào)節(jié)流速為0.6 mL/min，每5 min收集1管。活性菌C2－4共收集72管，活性菌21－1－1－2共收集76管。將洗脫液氮吹并稱量。將經(jīng)過葡聚糖凝膠層析柱純化后的抗菌物質(zhì)用制備型液相進(jìn)行分離和進(jìn)一步純化。使用的色譜柱為ODS制備型色譜柱（22 mm×250 mm，25μm），將樣品溶于甲醇中 （C2－4為12.4 mg/mL；21－1－1－2為16.1 mg/mL），經(jīng)0.45μm的過濾器過濾后采用乙腈－水（20∶80，V∶V）等度洗脫，進(jìn)樣量為500μL。檢測波長選擇210 nm，柱溫設(shè)定為25℃，流速為20 mL/min。根據(jù)不同的出峰時間，收集每個峰下的組分，分別蒸干后用甲醇復(fù)溶，以ATCC25922、ATCC29213作為指示菌進(jìn)行抑菌實驗。有活性的濃縮液4℃條件下保存。

（六）抗菌物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集用高效液相色譜串聯(lián)離子阱高分辨質(zhì)譜對次級代謝產(chǎn)物及提取出的抗菌物質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。液相條件為：色譜柱是Hypersil GOLDTMC18色譜柱 （100 mm×2.1 mm，1.9μm）；柱溫設(shè)定為25℃；采用梯度洗脫的方式，A相為含0.1%甲酸的水相，B相為含0.1%甲酸的乙腈。梯度洗脫程序為：0.0～1.0 min，5%的流動相B；1.0～3.0 min，5%～30%的流動相B；3.0～4.0 min，30%～40%的流動相B；4.0～5.5 min，40%～55%的流動相B；5.5～7.5 min，55%～95%的流動相B；7.5～9.0 min，95%～5%的流動相B；9.0～12.0 min，95%的流動相B。進(jìn)樣量為5μL；流速為0.3 mL/min。

質(zhì)譜檢測條件為：離子源參數(shù)為鞘氣的流速45 L/min；輔助氣的流速10 L/min；擋錐氣的流速0 L/min；電噴霧電壓3.5 kV；離子導(dǎo)管的溫度320℃；S－lens RF level設(shè)為60；離子源的溫度350℃。

采集的模式為正離子模式下的Full MSddMS2，其中Full MS的具體參數(shù)設(shè)置為：分辨率：17 500；AGC Target：1e6；Maximum IT：64 ms；Scan range：150～1 800 Da；Spectrum data type：profile。其中dd－MS2的具體參數(shù)設(shè)置為：分辨率：17 500；AGC Target：1e6；Maximum IT：64 ms；Loop count：15；Isolation window：1.2 Da；NCE：30、45；Scan range：200～2 000 Da；Spectrum data type：profile；dd Settings中，Minimum AGC：1.3e4；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：7.0 s。

（七）基于MZmine代謝產(chǎn)物質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，得到固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩種基質(zhì)下活性菌C2－4、21－1－1－2和ATCC 25922、29213各菌株的代謝產(chǎn)物信息，以及混合培養(yǎng)狀態(tài)下的共同的代謝產(chǎn)物信息。通過MZmine數(shù)據(jù)分析軟件分析各組間的差異。使用“feature detection”中的 “Mass detection”功能設(shè)置檢測器，一級掃描的噪音等級設(shè)置為1.0e8，二級掃描的噪音等級設(shè)置為1.0e4。使用“feature detection”中的“Chromatogram builder”建立色譜峰，“Min time span（min）”設(shè)置為0.1；“Min height”設(shè)置為1.0e8；“m/ztolerance”設(shè)置為0.04m/z。使用“Feature detection”中的“Chromatogram deconvolution”進(jìn)行色譜峰的分離，“Min peak height”設(shè)置為1.0e8；“Baseline level”設(shè) 置 為1.0e4。“m/zrange for MS2scan pairing”設(shè)置為0.02 Da；“RTrange for MS2scan pairing”設(shè)置為0.1。使用“Isotopes”中的“Isotopic peaks grouper”去除同位素峰，“m/ztolerance”設(shè)置為0.04m/z；“Retention time tolerance”設(shè)置為0.01；“Maximun charge”設(shè)置為3。使用“Alignment”中的“Join aligner”使所有特征峰根據(jù)保留時間和特征列表進(jìn)行對齊，“m/ztolerance”設(shè)置為0.04m/z；“Weight form/z”設(shè)置為75；“Weight forRT”設(shè)置為25；“Retention time tolerance”設(shè)置為0.01。最后，導(dǎo)出包含完整一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜的特征文件用于GNPS分析。

二、結(jié)果與分析

（一）活性菌的抗菌活性圖1顯示了實驗中活性菌的抗菌活性結(jié)果，可以看出各平板均出現(xiàn)明顯的抑菌圈，表明活性菌21－1－1－2、C2－4對大腸桿菌 ATCC25922及金黃色葡萄球菌ATCC29213均有較強的抑制作用。

（二）次級代謝產(chǎn)物質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析實驗中將兩株指示菌分別與活性菌混合培養(yǎng)，但活性菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)并沒有因為指示菌的不同而有顯著區(qū)別。因此僅選取大腸桿菌作為指示菌進(jìn)行混合培養(yǎng)時的代謝物差異來分析。以每種代謝物的質(zhì)荷比作為X軸，以log10（兩組代謝物含量比值）作為Y軸，如log10[（A+1）/（B+1）]，其中A為混合培養(yǎng)組的峰面積，B為指示菌單獨培養(yǎng)組的峰面積，得到差異代謝物的散點圖（見圖2）。由散點圖可以明顯看出差異物質(zhì)的質(zhì)荷比分布及差異的倍數(shù)大小。圖2中，Y軸的單位2、4、6分別表示了差異的倍數(shù)102、104、106；－2、－4、－6即表示了差異的倍數(shù)為10－2、10－4、10－6。距離X軸越遠(yuǎn)的點表示差異越大。

圖2 21－1－1－2（A）和C2－4（B）特異性代謝物散點圖

圖2中，X軸以上的點表示混合培養(yǎng)下代謝物含量明顯高于指示菌單獨培養(yǎng)時的代謝物含量（指示菌單獨培養(yǎng)下幾乎為0），即活性菌產(chǎn)生的特異性抗菌物質(zhì)。X軸以下的點表示指示菌單獨培養(yǎng)時的代謝物含量明顯高于混合培養(yǎng)下的代謝物含量（混合培養(yǎng)下幾乎為0），即為指示菌正常生長所必須的某種物質(zhì)。由圖2可見，活性菌21－1－1－2和C2－4的差異顯著的點的質(zhì)量數(shù)均主要分布在150～600之間。

結(jié)合散點圖及色譜峰圖中各峰形的優(yōu)劣，選取峰形優(yōu)秀的差異代謝物進(jìn)行分析。將固體基質(zhì)和液體基質(zhì)培養(yǎng)下的活性菌的特異性代謝產(chǎn)物分析結(jié)果合并，得到的活性菌特異代謝物結(jié)果如表1所示。

表1 兩株活性菌的特異性代謝產(chǎn)物質(zhì)譜信息表

由表1發(fā)現(xiàn)，21－1－1－2的特異性代謝產(chǎn)物有14種，C2－4的特異性代謝產(chǎn)物有9種，兩種活性菌共有的特異性代謝物有7種。證明兩株活性菌存在共同的代謝產(chǎn)物。

（三）特異性代謝物檢索將16種特異性代謝物的一二級碎片信息上傳至GNPS，用“MASST Search”功能檢索。經(jīng)“MASST Search”檢索發(fā)現(xiàn)，16種特異性代謝物中，只有質(zhì)荷比為566.426的代謝物檢索到了結(jié)果，其余15種特異性代謝物的檢索均匹配不到結(jié)果。質(zhì)荷比為566.426的代謝物的一二級質(zhì)譜信息與GNPS的數(shù)據(jù)庫里匹配度最高的結(jié)果為Lajollamide A。其“Cosine Score”結(jié)果為0.93，“Matched Peaks”為10。其鏡像匹配度如圖3所示。

圖3 代謝物鏡相匹配圖

（四）抗菌物質(zhì)質(zhì)譜分析鑒定經(jīng)與空白樣品對比，最終發(fā)現(xiàn)，活性菌C2－4和活性菌21－1－1－2所提取到的抗菌物質(zhì)的特異性色譜峰是相同的，說明兩株活性菌所分泌的抗菌物質(zhì)為同種物質(zhì)（見圖4）。

圖4 抗菌物質(zhì)的提取色譜圖及二級質(zhì)譜圖

根據(jù)二級質(zhì)譜圖可知，抗菌物質(zhì)被打碎成不同質(zhì)量大小的碎片，且其外側(cè)支鏈會優(yōu)先斷裂。碎片566.4比碎片435.3多131.1，推測碎片566.4比4 35.3多一個亮氨酸（Leu），同樣，碎片435.3與碎片322.2之間，碎片322.2與碎片209.1之間的差值均為131.1，同樣推測是多了一個Leu?？梢缘贸鲈摶衔锸且粋€含有3個Leu的肽類物質(zhì)。將質(zhì)譜檢測的數(shù)據(jù)上傳至GNPS，使用GNPS的“Molecular Networking”功能，“Precursor Ion Mass Tolerance”參數(shù)設(shè)置為0.02 Da；“Fragment Ion Mass Tolerance”設(shè)置為0.02 Da。使用檢索結(jié)果里的 “dereplicator+”二次提交工作流進(jìn)行檢索，結(jié)果為Lajollamide A。該結(jié)果與通過組間代謝差異檢索出的特異性代謝物結(jié)果相同，證明了通過組間差異性代謝物分析也可以對活性菌分泌的抗菌物質(zhì)進(jìn)行鑒定。

Lajollamide A是一種具有抗菌活性的環(huán)狀五肽化合物，相對分子質(zhì)量為565.8，分子式為C30H55N5O5。該化合物于2012年由GULDER等[24]首次從海洋絲狀真菌中提取發(fā)現(xiàn)。結(jié)合對二級碎片的分析，可以得出該抗菌物質(zhì)Lajollamide A的結(jié)構(gòu)（見圖5）。

圖5 活性菌抗菌物質(zhì)可能的結(jié)構(gòu)

有關(guān)Lajollamide A的文獻(xiàn)報道較少。Gulder等[24]通過核磁共振結(jié)合質(zhì)譜分析獲得了其結(jié)構(gòu)信息，并研究發(fā)現(xiàn)了Lajollamide A對革蘭氏陽性菌、枯草芽孢桿菌及表皮葡萄球菌的抑菌活性。Lajollamide A的發(fā)現(xiàn)對海洋微生物資源的利用和新型抗生素的發(fā)掘具有重要意義。

三、結(jié)論

本文建立了一種快速確定活性菌特異性代謝產(chǎn)物的方法。主要是基于高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，同時借助MZmine分析軟件分析了活性菌的代謝產(chǎn)物差異，將處理后的數(shù)據(jù)導(dǎo)入GNPS平臺獲得活性菌的特異性代謝產(chǎn)物信息，將該方法應(yīng)用于抗菌物質(zhì)的鑒定，尋找到活性菌C2－4的特異性代謝產(chǎn)物9種，只有質(zhì)荷比為566.426的代謝產(chǎn)物在數(shù)據(jù)庫中檢索到了結(jié)果，為Lajollamide A；尋找到活性菌21－1－1－2的特異性代謝產(chǎn)物14種，同樣只有質(zhì)荷比為566.426的代謝產(chǎn)物在數(shù)據(jù)庫中檢索到了結(jié)果，為Lajollamide A。此結(jié)果與活性菌中提取到的抗菌物質(zhì)一致。本方法操作簡便，省去了復(fù)雜的提取、純化的步驟，可直接得到目標(biāo)物的信息，能快速準(zhǔn)確地確定活性菌的特異性代謝產(chǎn)物。