酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍生長性能與免疫功能的影響

李佑杰，李永安，李淑瑤，王自蕊

（江西農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，江西 南昌 330045）

【研究意義】在養(yǎng)殖業(yè)中，動物在高度密集的規(guī)模化養(yǎng)殖情況下健康狀態(tài)出現(xiàn)了明顯的問題，過度使用抗生素造成養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)對抗生素的極度依賴。由于大劑量長期使用抗生素帶來的藥物殘留、細菌耐藥性增強等負面影響也受到社會的廣泛關注。而在不久前國家全面啟動減抗禁抗，在促生長類飼料抗生素禁用的大背景下，探討替代性技術是當前乃至今后較長一段時間的重要研究方向之一?！厩叭搜芯窟M展】針對飼用抗生素存在的弊端和問題，目前市場上陸續(xù)開發(fā)推出了飼用酶制劑[1]、飼用微生物制劑[2]、酸化劑[3]、抗菌肽[4]、寡聚糖[5]、大蒜素[6]、中草藥[7]以及有機金屬微量元素[8]等抗生素替代品，并在各種動物身上取得良好效果，這些綠色飼料添加劑尤其是微生物制劑和植物提取物獲得了人們的青睞?！颈狙芯壳腥朦c】酵母培養(yǎng)物（yeast culture）是指在特定工藝條件下由酵母菌在特定培養(yǎng)基中經(jīng)發(fā)酵、干燥得到的微生態(tài)制品，主要由酵母菌體、次級代謝物、殘余的培養(yǎng)基等成分構成。當前，抗生素最令人擔憂的問題之一是其副作用，因為它們會損害微生物群[9]，而噬菌體的特異性功能可以解決這個問題。因此，酵母培養(yǎng)物被認為是現(xiàn)有抗生素的真正替代品。有研究表明，酵母培養(yǎng)物具有無毒副作用、不產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點，且含有豐富的營養(yǎng)物質，如維生素和有機酸等，能夠提高試驗動物生長性能、提高飼料利用率，調(diào)節(jié)動物腸道菌群，改善腸道健康狀況[10-11]。酵母培養(yǎng)物最初應用在反芻動物身上，效果良好，如張學峰等[12]總結了酵母培養(yǎng)物在一些反芻動物生產(chǎn)中的營養(yǎng)和保健作用。大鱗副泥鰍（Paramisgurnus dabyranus）隸屬于鯉形目、鰍科、副泥鰍屬[13],因其適應性強是一種比較適合養(yǎng)殖的經(jīng)濟魚類，但由于其規(guī)模小、產(chǎn)量低，一直處于供不應求的階段。關鍵是目前市場上缺乏較科學的泥鰍人工配合飼料，對泥鰍配合飼料及營養(yǎng)需要的研究很少，幾乎空白。近幾年來，人們對于酵母培養(yǎng)物在畜禽中的飼喂試驗也日益增加，但是，關于酵母培養(yǎng)物調(diào)節(jié)水產(chǎn)動物腸道健康的研究還很少，尤其是在泥鰍上的研究甚少?！緮M解決的關鍵問題】因此，本研究旨在探明適合泥鰍生長的無抗綠色環(huán)保飼料，并擬探討酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍生長性能及免疫功能的影響。研究結果可為酵母培養(yǎng)物在泥鰍飼料中的科學應用提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

按照配方設計將飼料分為4個組，在基礎飼料中添加不同含量的酵母培養(yǎng)物，用纖維素配平，分別為對照組、1%酵母培養(yǎng)物添加組、2%酵母培養(yǎng)物添加組和3%酵母培養(yǎng)物添加組。將原料粉碎過80目篩，經(jīng)混合制粒膨化成1 mm粒徑的顆粒飼料。飼料配方及營養(yǎng)成分見表1。

表1 基礎日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Ingredients and proximate composition of the basal diets %

1.2 試驗魚

試驗魚購于江西省豐城市春鰍養(yǎng)殖專業(yè)合作社。在分組前，對試驗大鱗副泥鰍進行投喂2周的商品料來馴化大鱗副泥鰍。挑選出800 尾體質健壯、規(guī)格均一且初始均質量為（5.91±0.03）g 的試驗泥鰍，試驗共設4個處理，每個處理4個重復，每個重復50尾泥鰍。

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗地點為江西農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)養(yǎng)殖基地。養(yǎng)殖試驗在室內(nèi)進行，試驗大鱗副泥鰍養(yǎng)殖容器的規(guī)格為80 cm×66 cm×64 cm。養(yǎng)殖用水為提前曝氣的自來水，水體24 h不間斷增氧，且在桶內(nèi)放置加熱棒以維持泥鰍生長較適宜的水溫。養(yǎng)殖周期為8 周，每天09:00 和16:00 對泥鰍進行投喂，并且定期對養(yǎng)殖用水進行更換。每天觀察泥鰍攝食情況和死亡情況并記錄，同時記錄每天的水溫。飼養(yǎng)期間水溫15～25 ℃，pH 7.0 左右，溶解氧含量大于5.0 mg/L。

1.4 樣品采集與指標分析

1.4.1 生長性能 養(yǎng)殖試驗結束后，停食24 h，將每個桶所有泥鰍打撈起來稱質量、計數(shù)，計算其均質量、增重率、飼料系數(shù)、成活率、肝體指數(shù)、臟體指數(shù)、肥滿度、特定生長率。

1.4.2 全魚體成分 從每個箱子里面隨機取5尾魚，采用國標法測定其水分含量、粗蛋白質含量、粗脂肪含量、粗灰分含量。水分在105 ℃烘箱中烘干測定，粗蛋白質采用凱氏半自動定氮儀測定，粗脂肪采用索氏提取器測定，粗灰分在馬弗爐中550 ℃灼燒測定。

1.4.3 血液生化指標與免疫指標 從每個重復中隨機選取泥鰍7 尾，用一次性1 mL 注射器從尾靜脈取血，置于0.2 mL離心管中，于冰箱中靜置后，用離心機3 000 r/min離心15 min，將血清分離出來，并把每個重復血清混合后進行測定。測定血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、葡萄糖（GLU）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）、溶菌酶（LSZ）活力、超氧化物歧化酶（SOD）活力。血清生化指標由上海優(yōu)選生物科技有限公司提供的自動生化儀測定（BS200 型）；超氧化物歧化酶是由上海優(yōu)選生物科技有限公司提供的試劑盒檢測，采用比色法測定；溶菌酶也采用比色法測定，試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.4.4 組織形態(tài)結構 對試驗魚進行解剖，取出其內(nèi)臟團，將腸道分離出來并剔除表面脂肪組織，分別取大小為4 mm×4 mm 的肝胰臟和長度為1 cm 左右的中腸，于PBS 緩沖液中浸泡沖洗，除去血液、糞便等雜質，置于10%甲醛固定，用于制作組織切片。固定好的中腸、肝臟經(jīng)石蠟切片脫蠟至水、蘇木素染色、伊紅染色和脫水封裝制成石蠟切片。每組選取4 張不連續(xù)切片，每張切片選取4 個視野，在光學顯微鏡下觀察中腸切片（×100 倍）、肝臟切片（×400 倍），并測定腸道絨毛高度（villus height）、寬度（villus width）、隱窩深度（crypt depth），計算其平均值作為測定數(shù)據(jù)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），以平均值及其相應的標準誤表示（mean±SE），并作Duncan’s多重比較，P<0.05表示差異顯著。

2 結果分析

2.1 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍生長性能的影響

經(jīng)過8周的投喂試驗，酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍生長性能、飼料系數(shù)、存活率的影響如表2所示。在正式試驗進行4周后，YC3處理組增重率、特定生長率較對照組和YC1處理組均顯著提高（P<0.05），與YC2處理組差異不明顯（P>0.05），對照組與YC1處理組無顯著性差異（P>0.05）。喂養(yǎng)8周后，YC1、YC2處理組存活率顯著高于對照組（P<0.05），且YC1處理組最高，達到99%，與YC3處理組相比無明顯差異（P>0.05），YC3處理組與對照組之間無顯著性差異（P>0.05）。YC1處理組飼料系數(shù)最低，顯著低于對照組和YC3處理組（P<0.05）,與YC2處理組差異不顯著（P>0.05）。酵母培養(yǎng)物添加組增重率、特定生長率有升高趨勢，但不顯著（P>0.05），酵母培養(yǎng)物添加組臟體指數(shù)、肝體脂數(shù)、肥滿度與對照組均無顯著性差異（P>0.05）。

表2 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍生長性能的影響Tab.2 Effects of east culture on growth performance of Paramisgurnus dabyranus

2.2 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍體成分的影響

如表3所示，酵母培養(yǎng)物添加組泥鰍全魚水分、粗灰分含量較對照組差異均不顯著（P>0.05）。YC3處理組泥鰍全魚粗脂肪含量最高，達到28.49%，比對照組高出了5.44%，且顯著高于其他處理組（P<0.05），其余各組之間無顯著性差異（P>0.05）。YC2、YC3處理組泥鰍全魚粗蛋白含量顯著低于對照組（P<0.05），且YC3處理組顯著低于YC2處理組（P<0.05），YC1處理組與對照組之間差異不顯著（P>0.05）。

表3 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍體成分的影響（干物質基礎）Tab.3 Effects of yeast culture on body composition of Paramisgurnus dabyranus（dry matter basis）

2.3 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍血清生化指標及免疫指標的影響

酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍血清生化指標、免疫指標的影響分別見表4、5。在基礎飼料中添加酵母培養(yǎng)物后，處理組泥鰍血清ALT活力顯著降低（P<0.05），YC1、YC3處理組降低更為明顯，且YC3處理組顯著低于YC2處理組（P<0.05），與YC1處理組無顯著性差異（P>0.05），YC1與YC2處理組差異不顯著（P>0.05）。YC1處理組TG、TC 含量與其余各組相比均顯著降低（P<0.05），YC2、YC3處理組TG 含量與對照組之間無顯著性差異（P>0.05），但TC 含量均顯著高于對照組（P<0.05）。YC2、YC3處理組血清AST 活力、LDL-C含量與對照組和YC1處理組相比均顯著升高（P<0.05），且YC1處理組與對照組無顯著性差異（P>0.05）。YC1處理組HDL-C 含量顯著低于對照組和YC2處理組（P<0.05），與YC3處理組無顯著性差異（P>0.05），且YC3處理組顯著低于對照組（P<0.05），與YC2處理組無顯著性差異（P>0.05）。各組之間GLU 含量均無顯著性差異（P>0.05）。YC1處理組血清SOD 活力顯著高于其余各組（P<0.05），且其余各組之間差異不顯著（P>0.05），YC1、YC2處理組LSZ活力顯著高于對照組和YC3處理組（P<0.05），YC1處理組活力最高，且與YC2處理組無顯著性差異（P>0.05），YC3處理組與對照組無顯著性差異（P>0.05）。

表4 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍血清生化指標的影響Tab.4 Effects of yeast culture on serum biochemical indices of Paramisgurnus dabyranus

2.4 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍腸形態(tài)指標的影響

酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍腸形態(tài)指標的影響如表6 所示。從表6 可知，與對照組相比，在基礎飼料中添加酵母培養(yǎng)物可顯著提高大鱗副泥鰍腸絨毛高度（P<0.05），并且能顯著降低隱窩深度（P<0.05），各處理組之間差異不顯著（P>0.05），且YC1處理組絨毛高度最高，隱窩深度最低。

表6 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍腸形態(tài)指標的影響Tab.6 Effects of yeast culture on intestinal morphology indexes of Paramisgurnus dabyranus

表5 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍血清免疫指標的影響Tab.5 Effects of yeast culture on serum immune indexes of Paramisgurnus dabyranus

圖1 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍腸組織形態(tài)的影響Fig.1 Effects of yeast culture on intestinal tissue morphology of Paramisgurnus dabyranus

2.5 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍肝臟組織結構的影響

酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍肝臟組織結構的影響見圖2。由圖可知，YC1處理組肝臟結構較為完整，小葉結構明顯，可見肝細胞以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列。肝細胞界限較為清晰，細胞核大多位于細胞中央，肝血竇中可見血細胞，肝臟較為健康；對照組和YC2處理組出現(xiàn)細胞核聚集和核偏位的現(xiàn)象；YC3處理組細胞排列擁擠，部分細胞體積增大并且腫脹，出現(xiàn)細胞破裂的現(xiàn)象，且空泡化嚴重。

圖2 酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍肝臟組織結構的影響Fig.2 Effects of yeast culture on liver tissue structure of Paramisgurnus dabyranus

3 討論與結論

有研究表明，酵母培養(yǎng)物能提高飼養(yǎng)動物生長性能、飼料利用率，增強機體抗病力和改善生存環(huán)境。劉立鶴等[14]在飼料中添加酵母培養(yǎng)物益寧易SCP對改善草魚的生長性能有一定的作用，只是這種作用并不顯著，具體表現(xiàn)為隨著添加量的增加增重率總體呈現(xiàn)出上升的趨勢，增重率上升的原因與益寧易SCP提供的有機酸、維生素等營養(yǎng)物質有關，一定程度上促進了草魚對營養(yǎng)成分的吸收，與本試驗研究結果相一致。研究表明，在飼料中添加酵母核苷酸[15]和酵母培養(yǎng)物[10,16]能在不同程度上降低對蝦的飼料系數(shù)，改善對蝦的生長性能。在本試驗條件下，酵母培養(yǎng)物改善了大鱗副泥鰍的生長性能，YC1處理組飼料系數(shù)顯著降低，但隨著酵母培養(yǎng)物添加量的上升，飼料系數(shù)反而升高，且與對照組差異不明顯，這說明適量的酵母培養(yǎng)物能提高飼料利用率，同時過量并不會使大鱗副泥鰍的生長性能得到改善，這與何遠法等[17]在凡納濱對蝦上的研究結果一致，可能由于過高劑量酵母培養(yǎng)物引起的過度免疫反應，使用于生長的能量或營養(yǎng)素減少[18]。在不同試驗中酵母培養(yǎng)物添加組成活率高于對照組，酵母培養(yǎng)物提高了動物免疫力和抗應激能力，進而提高養(yǎng)殖動物成活率[19-20]。本研究中，酵母培養(yǎng)物添加組大鱗副泥鰍存活率均得到提高，且YC1處理組存活率最高，這或許說明了在飼料中添加一定量的酵母培養(yǎng)物能增強大鱗副泥鰍抗病害的能力。

泥鰍體成分是反映魚體健康狀況的重要指標。STEPHEN等[21]研究表明，飼料中添加2%酵母培養(yǎng)物能提高蝦體粗脂肪含量，與本試驗3%最高添加量研究結果一致；ZHENG 等[22]也指出在飼料中添加酵母提取物能使蝦體粗脂肪含量升高。綜上所述，飼料中一定添加量的酵母培養(yǎng)物能促進脂肪在體內(nèi)的沉積，為魚體儲存并提供更多的能量物質。在本試驗中，體蛋白含量下降的結果可能是由于魚群種類和飼料組成的差異造成的[21]，且高劑量酵母培養(yǎng)物導致蛋白質合成過程中營養(yǎng)物質的供應減少，對體蛋白沉積起抑制作用，具體機理還有待研究。

魚類營養(yǎng)和一些組織的健康狀況可以通過血清生化指標的變化反映出來[23]。ALT 和AST 在肝臟非必需氨基酸合成時起轉移氨基的作用，對氨基酸的合成和蛋白質的代謝有重要意義；當肝臟受損時，血液中ALT 和AST 含量會升高[24-25]。研究表明，在飼料中添加酵母培養(yǎng)物能使血清ALT、AST 活力顯著降低，提高機體非特異性免疫能力[26]；ADEOYE 等[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，自溶酵母能顯著降低血清ALT 活力，因其作為生物活性補充劑有助于保護肝細胞膜的完整性，并在一定范圍內(nèi)優(yōu)化肝功能，但也伴隨著AST活力水平的提高，這可能與酵母核苷酸促進蛋白質合成代謝激活了AST 的活性，還有待研究證實；本試驗中ALT、AST 活力變化與自溶酵母試驗結果一致，然而在YC1處理組AST 活力水平并未上升，YC1處理組ALT、AST 低水平活力說明了在飼料中添加適量的酵母培養(yǎng)物不會影響肝臟的正常狀況，且對肝細胞有一定的保護作用。血清TG和TC作為體脂肪的一部分[27]，其活性是反映機體脂肪吸收狀況和肝臟脂肪代謝的重要指標[28]。桂良超等[29]在酵母培養(yǎng)物作為替代物的試驗中，發(fā)現(xiàn)酵母培養(yǎng)物能降低血清TG 和TC的含量。而在本實驗中，僅有YC1處理組能顯著降低血清TG 和TC 含量，這可能是由于酵母培養(yǎng)物中含有的豐富的有機酸提高了脂肪酶的活性，加速了脂肪的代謝[30]，說明了適量的酵母培養(yǎng)物能促進脂肪代謝，減少脂肪在肝臟中過度沉積。SOD 是一種以自由基為底物的抗氧化酶，可以清除體內(nèi)的自由基，調(diào)節(jié)氧化應激，分解超氧化物，能增強機體抗病力，在機體防御中起重要作用[31-32]。孫強東等[33]在斷奶仔豬的試驗中發(fā)現(xiàn)，酵母培養(yǎng)物并沒有顯著提高血清SOD 活力，而在雷宇杰等[34]的研究中證明了飼料中添加酵母培養(yǎng)物能使血清SOD 活力增加顯著。在本研究中YC1處理組SOD 活力顯然高于其余各組，大鱗副泥鰍抗氧化能力得到提高。LSZ 是生物體內(nèi)重要的非特異性免疫因子，它可以水解細菌細胞壁，具有消化分解細菌、抑制外源微生物生長、增強機體免疫力的作用[35]。程鑫等[36]報道，酵母培養(yǎng)物添加組黃顙魚血清的LSZ 活性均高于試驗組，這與本試驗結果一致，且本試驗中YC1處理組活性最高，活力增加最明顯。酵母培養(yǎng)物含有豐富的β-葡聚糖、甘露寡糖和核苷酸等免疫刺激物質，能夠誘導、刺激和啟動動物的免疫機能或可強化免疫系統(tǒng)任何功能組件，以提高動物的免疫力和抗病力[34]，這些免疫刺激物質在鯉魚[37]、草魚[38]、羅非魚[39]等動物中已得到應用并產(chǎn)生優(yōu)良效果，本試驗YC1處理組血清SOD、LSZ 活力在這些免疫刺激物質的誘導下得到明顯提高，從而提高了存活率。本研究中測定的營養(yǎng)指標反映了酵母培養(yǎng)物對大鱗副泥鰍全魚品質以及對營養(yǎng)物質消化吸收功能的調(diào)控作用；而免疫指標則反映了酵母培養(yǎng)物對魚體免疫力和抗病力的影響，即而反映出了存活率和飼料效率的變化。營養(yǎng)指標與免疫指標總體反映了魚體的健康狀況。

腸絨毛高度、隱窩深度是衡量腸細胞功能的重要指標。腸絨毛高度與細胞數(shù)量相關，能影響對營養(yǎng)物質的吸收表面積，隱窩深度在功能上影響消化吸收機能[40]。絨毛增高能增大腸吸收表面積，隱窩變淺能使腸上皮細胞成熟率提高[41]。在本試驗條件下，腸絨毛高度在酵母培養(yǎng)物添加組中均得到顯著提高，隱窩深度顯著降低，有利于泥鰍對營養(yǎng)物質的吸收,與肖曼[42]研究結果基本一致，劉立鶴等[14]在草魚和李高鋒等[43]在團頭魴的研究中也發(fā)現(xiàn)酵母培養(yǎng)物能改善腸道功能，增加絨毛高度。從腸切片來看，YC1處理組絨毛結構更完整，排列較其他組更緊密，說明適量酵母培養(yǎng)物能在一定程度上改善腸道結構；酵母培養(yǎng)物對腸道的改善可能與魚類消化器官的完整性、生長發(fā)育有關，由于酵母培養(yǎng)物為腸道微生物提供豐富的營養(yǎng)物質促進了試驗動物腸道微生物生長，增加有益菌數(shù)量，改善腸道形態(tài)結構和功能的完整性[44]。肝臟是動物機體在物質能量代謝過程中具有重要而特殊功能的臟器[44-45]。在本試驗中，YC1處理組相對于其余各組肝臟組織結構較為完整，一定程度上改善了肝臟功能。

在本試驗條件下，飼料中添加1%酵母培養(yǎng)物能顯著降低飼料系數(shù)，對大鱗副泥鰍的生長性能有促進作用，同時也能顯著提高大鱗副泥鰍的免疫能力，增強機體抗病力，提高存活率，也可改善腸道消化吸收能力，為酵母培養(yǎng)物替代抗生素提供了可行的依據(jù)。