miR-7081-5p靶向SOX6對(duì)羊駝黑色素細(xì)胞色素的調(diào)控

王 飛，鐘圣偉，李 勇，胡小芬，周作紅，楊?yuàn)檴?/p>

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 江西 南昌 330045）

【研究意義】羊駝具有觀(guān)賞和毛用雙重價(jià)值。目前，一般采用化學(xué)染料對(duì)動(dòng)物毛發(fā)進(jìn)行染色，以獲得顏色多樣的動(dòng)物絨毛制品，但是化學(xué)染色對(duì)環(huán)境和健康的負(fù)面影響很大。對(duì)毛色發(fā)生機(jī)制的研究，為獲得人為控制的天然動(dòng)物毛色提供重要理論意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNAs，一類(lèi)長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)與靶基因mRNA 的3′-UTR 不完全互補(bǔ)配對(duì)，從而調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄后水平的表達(dá)[1]。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明miRNAs調(diào)控許多重要的生物進(jìn)程，如腫瘤的發(fā)生、炎癥和發(fā)育等[2]。miRNAs對(duì)動(dòng)物毛色的表型或黑色素生成具有一定的影響，如miR-137通過(guò)靶向MITF導(dǎo)致小鼠毛色從黑色變?yōu)樽鼗疑玔3]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】基于實(shí)驗(yàn)室前期的研究[4]，發(fā)現(xiàn)miR-7081-5p在白色和棕色羊駝皮膚中呈差異表達(dá)，推測(cè)miR-7081-5p 可能參與毛色的形成。通過(guò)miRBase、TargetScan 等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-7081-5p的靶基因，均發(fā)現(xiàn)sex-determining region Y-box 6（SOX6）為miR-7081-5p的靶基因之一。最近的研究表明SOX6在色素生成中具有一定的作用[5]。因此推測(cè)miR-7081-5p可能通過(guò)抑制靶基因SOX6的表達(dá)進(jìn)而影響黑色素細(xì)胞內(nèi)色素的生成?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究通過(guò)在羊駝黑色素細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-7081-5p檢測(cè)SOX6及相關(guān)色素生成基因的表達(dá)變化，酪氨酸酶活性的變化，以及總黑色素，真黑素和褐黑素的含量變化，從而為揭示miR-7081-5p靶向SOX6在色素生成過(guò)程中的分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

黑色素細(xì)胞專(zhuān)用培養(yǎng)基（Sciencell，美國(guó)），基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖校ū淘铺?，上海），雙熒光報(bào)告檢測(cè)試劑盒（Promega，美國(guó)），DNA 凝膠回收試劑盒（碧云天，上海），兔抗多克隆一抗：SOX6、MITF、TYR、TYRP1和TYRP2（Abcam，美國(guó)），兔抗β-actin 多克隆一抗（康為世紀(jì)，北京），山羊抗兔二抗（康為世紀(jì)，北京），Trizol（Invitrogen，美國(guó)），轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2 000（Invitrogen，美國(guó)），qRT-PCR 試劑盒（Takara，大連），RIPA 裂解液（碧云天，上海），pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-7081-5p 真核表達(dá)載體由Invitrogen 公司合成，引物由北京六合華大科技股份有限公司合成。

1.2 pmirGL0-SOX6 3'-UTR雙熒光報(bào)告載體和突變載體的構(gòu)建

羊駝來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)羊駝養(yǎng)殖基地，背部剪毛，消毒后，用取皮器采取皮膚組織，并置液氮中保存。研磨后，用Trizol法提取RNA，并轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRBase生物學(xué)軟件中SOX63′-UTR 的序列利用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，并加相應(yīng)的酶切位點(diǎn)，以羊駝皮膚cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：Mix 5 μL，F(xiàn)orward primer 0.4 μL，Reverse primer 0.4 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 補(bǔ)足至10 μL。反應(yīng)結(jié)束對(duì)所擴(kuò)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序正確后，回收產(chǎn)物和pmirGL0分別進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，將其酶切產(chǎn)物進(jìn)行T4連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，測(cè)序，從而獲得pmirGL0-SOX6 3′-UTR 雙熒光報(bào)告載體，命名為SOX6-wt。以pmirGL0-SOX6 3′-UTR 雙熒光報(bào)告載體為模板，按照基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行靶位點(diǎn)的堿基突變?cè)囼?yàn)，將突變后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，測(cè)序，從而獲得pmirGL0-SOX6 3′-UTR突變載體，命名為SOX6-mut。質(zhì)粒于-80 ℃保存，備用。所用引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-7081-5p和mRNAs引物序列Tab.1 miR-7081-5p and mRNAs primer sequences

1.3 靶基因驗(yàn)證試驗(yàn)

培養(yǎng)HEK 293T 細(xì)胞，待其融合度達(dá)到60%～75%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染設(shè)為2 組：（1）SOX6-wt+miR-7081-5p/NC，（2）SOX6-mut+miR-7081-5p/NC，進(jìn)行共轉(zhuǎn)染，每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)。待轉(zhuǎn)染結(jié)束后，收集細(xì)胞，按照雙熒光報(bào)告檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分別讀取海腎和螢火蟲(chóng)熒光素酶反應(yīng)強(qiáng)度值。螢火蟲(chóng)螢光素酶值/海腎螢光素酶值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所用引物序列見(jiàn)表1。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)

培養(yǎng)羊駝黑色素細(xì)胞至融合度60%～75%時(shí)，進(jìn)行miR-7081-5p/NC 轉(zhuǎn)染（每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)）。轉(zhuǎn)染56 h 后，用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，用NanoDrop 測(cè)其OD260/OD280值及濃度，取1 μL 進(jìn)行RNA 快速凝膠電泳，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。按照qRT-PCR 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。目的基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct[6]進(jìn)行計(jì)算，熒光實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果均用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Means±SD）表示，其中各基因的表達(dá)量所示結(jié)果均由內(nèi)參基因β-actin的表達(dá)量進(jìn)行校正，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

1.5 Western blotting蛋白免疫印跡試驗(yàn)

培養(yǎng)羊駝黑色素細(xì)胞至融合度60%～75%時(shí)，進(jìn)行miR-7081-5p/NC 轉(zhuǎn)染（每組設(shè)3 個(gè)重復(fù)）。轉(zhuǎn)染56 h 后，用RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)其濃度后進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至NC 膜。NC 膜用5%封閉液進(jìn)行封閉，1 h。加入稀釋后的一抗，4 ℃，過(guò)夜孵育。次日室溫回溫30 min，洗膜，5 min×6 次，用含有HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃，孵育1 h。洗膜后用ECL 發(fā)光試劑盒顯色后曝光。對(duì)獲得的目的條帶進(jìn)行掃描分析。利用Image-ProPlus 6.0軟件測(cè)定目的蛋白的灰度值，并進(jìn)行半定量分析。數(shù)據(jù)用Means±SD表示，全部數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)。

1.6 細(xì)胞免疫組織化學(xué)

將培養(yǎng)好的黑色素細(xì)胞消化后接種于含有爬片的24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)染56 h 后，取出。PBS 沖洗，4%多聚甲醛固定20 min，3%過(guò)氧化氫室溫孵育15 min，PBS 沖洗，細(xì)胞爬片用牛血清白蛋白封閉，37 ℃，25 min。在爬片上滴加稀釋后的SOX6 一抗，4 ℃，過(guò)夜孵育。次日，洗膜后，用含有HRP 標(biāo)記的二抗，37 ℃，孵育30 min。DAB顯色后，在顯微鏡下觀(guān)察結(jié)果。設(shè)陰性對(duì)照組，用IgG代替一抗。

1.7 黑色素含量的測(cè)定

培養(yǎng)羊駝黑色素細(xì)胞至融合度60%～75%時(shí)，進(jìn)行miR-7081-5p/NC轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染56 h后，PBS吹洗并消化計(jì)數(shù)?？偤谒氐臏y(cè)定：在細(xì)胞團(tuán)塊中加入300 μL 的0.2 mol/L 的NaOH 溶液，充分溶解后，80 ℃，5 min。酶標(biāo)儀475 nm下測(cè)其OD值。真黑素的測(cè)定：在細(xì)胞團(tuán)塊中加入300 μL 30%的氫碘酸，80 ℃，2 h；冷卻后，加入300 μL 50%乙醇，2 234 g離心10 min，取沉淀；在沉淀中加入0.2 mol/L的NaOH，80 ℃，4 h，取溶解后的樣品，10 700 g 離心10 min，取上清，酶標(biāo)儀350 nm 下測(cè)其OD 值。褐黑素的測(cè)定：在細(xì)胞團(tuán)塊中加入300 μL 0.1 mol/L PBS（pH=10.5），室溫劇烈混合10 min，10 000 r/min，離心10 min，取上清。在上清液中加入300 μL氯仿，振蕩混勻，4 000 r/min，離心10 min，取黃色上清液。上清液，10 000 g，離心10 min。取上清，酶標(biāo)儀400 nm下測(cè)其OD值。每組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.8 酪氨酸酶活性的測(cè)定

培養(yǎng)羊駝黑色素細(xì)胞至融合度60%～75%時(shí)，進(jìn)行miR-7081-5p/NC轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染56 h后，消化離心，PBS清洗3次；PBS重懸細(xì)胞，加入96孔板，100 μL/孔，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)；每孔加入1%Triton X-100，100 μL，混勻，20 ℃，孵育1 h；加入PBS稀釋的0.1%的左旋多巴，100 μL，37 ℃，孵育2 h，酶標(biāo)儀460 nm測(cè)其OD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 羊駝皮膚總RNA的鑒定

Trizol 法提取羊駝皮膚總RNA，用核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其濃度和質(zhì)量，并進(jìn)行凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)RNA。核酸測(cè)定儀測(cè)定OD260/OD280比值為1.80～2.00，其純度較好；凝膠電泳結(jié)果顯示，RNA 樣品的28S，18S和5S條帶清晰可見(jiàn)，符合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求（圖1）。

圖1 皮膚總RNA 1%凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Total RNA of skin by 1%agrose gel

2.2 SOX6為miR-7081-5p的靶基因

miRBase、TargetScan 等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-7081-5p 的靶基因，均發(fā)現(xiàn)SOX6是miR-7081-5p 的靶基因，且具有7 個(gè)nt 種子序列（圖2A）。SOX6-wt/ pmirGL0-SOX6-mut 和miR-7081-5p/NC，共轉(zhuǎn)染HEK 293T 細(xì)胞后，檢測(cè)熒光信號(hào)的變化情況。結(jié)果顯示：與SOX6-wt+NC 組相比，pmirGL0-SOX6 -wt+miR-7081-5p 組熒光素酶活性顯著下調(diào)42.54%（圖2B）；與SOX6-mut+NC組相比，SOX6-mut+miR-7081-5p組熒光素酶活性無(wú)顯著變化（圖2C），通過(guò)熒光素酶活性的檢測(cè)證實(shí)SOX6 是miR-7081-5p 的靶基因。

圖2 SOX6與miR-7081-5p靶向關(guān)系驗(yàn)證Fig.2 SOX6 is one of target genes of miR-7081-5p

2.3 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)SOX6 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響

運(yùn)用qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-7081-5p 和NC 后的表達(dá)量變化。結(jié)果顯示：miR-7081-5p 組內(nèi)miR-7081-5p 的表達(dá)量顯著顯著高于NC 組，為NC 組的5.11 倍（圖3A），可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。qRT-PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-7081-5p 后SOX6 基因的表達(dá)差異。結(jié)果顯示：與NC 組相比，miR-7081-5p 組內(nèi)SOX6 mRNA 表達(dá)水平降低40.51%，差異顯著（圖3B）。Western blotting 和細(xì)胞免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與NC 組相比，miR-7081-5p組內(nèi)SOX6蛋白表達(dá)水平降低71.69%，差異顯著（見(jiàn)圖3C～E）。這些結(jié)果表明：SOX6基因的表達(dá)受miR-7081-5p的調(diào)控。

圖3 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)SOX6 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響Fig.3 The effect on mRNA and protein expression levels of SOX6 in melanocytes overexpressed miR-7081-5p

2.4 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素生成相關(guān)基因和蛋白表達(dá)水平的影響

運(yùn)用qRT-PCR 和Western blotting 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-7081-5p 過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素生成相關(guān)基因的影響。qRT-PCR結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-7081-5p組MITF、TYR、TYRP1和TYRP2mRNA表達(dá)水平分別降低63.63%、59.22%、58.84%和63.80%（圖4A）；Western blotting結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-7081-5p組MITF、TYR、TYRP1和TYRP2蛋白表達(dá)水平分別降低65.23%、63.23%、58.52%和62.95%，差異顯著（圖4B～C）。

圖4 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素生成相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響Fig.4 The effect on mRNA and protein expression levels of melanogenesis-related genes in melanocytes overexpressed miR-7081-5p

2.5 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素含量的影響

miR-7081-5p 轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞56 h 后，分別收集miR-7081-5p 組和NC 組的黑色素細(xì)胞并計(jì)數(shù)。提取各組內(nèi)總黑色素、真黑素和褐黑素后，根據(jù)各組細(xì)胞數(shù)量及OD值計(jì)算總黑色素、真黑素和褐黑素的相對(duì)含量。結(jié)果顯示：與NC 組相比，miR-7081-5p組總黑色素、真黑素和褐黑素的相對(duì)含量分別下降了49.03%、62.4%和63.8%，差異顯著（圖5）。

圖5 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)黑色素含量的影響Fig.5 The effect on melanin amount of melanocytes overexpressed miR-7081-5p

2.6 miR-7081-5p過(guò)表達(dá)對(duì)酪氨酸酶活性的影響

miR-7081-5p轉(zhuǎn)染羊駝黑色素細(xì)胞56 h后，分別收集miR-7081-5p組和NC組的黑色素細(xì)胞，進(jìn)行酪氨酸酶活性的測(cè)定。結(jié)果顯示：與NC組相比，miR-7081-5p組酪氨酸酶活性顯著降低了63.06%（圖6）。

圖6 過(guò)表達(dá)miR-7081-5p對(duì)酪氨酸酶活性的影響Fig.6 The effect on tyrosinase activity in melanocytes overexpressed miR-7081-5p

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法在羊駝黑色素細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-7081-5p 后，引起黑色素細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的變化，導(dǎo)致靶基因SOX6和與色素生成關(guān)鍵基因表達(dá)水平降低，并降低了酪氨酸酶活性，最終導(dǎo)致黑色素含量的降低。

黑色素顆粒由皮膚內(nèi)的色素細(xì)胞合成，決定動(dòng)物毛發(fā)和人類(lèi)皮膚的顏色，并能保護(hù)皮膚免受紫外線(xiàn)輻射所造成的傷害。動(dòng)物黑色素主要分為真黑色素和褐黑色素兩種，并且兩者的相對(duì)數(shù)量及分布決定動(dòng)物皮膚及被毛的顏色[7]。越來(lái)越多的研究表明：microRNAs（miRNAs）在人類(lèi)和其他脊椎動(dòng)物毛發(fā)和膚色中具有重要的作用[8]。前期通過(guò)對(duì)不同毛色羊駝皮膚miRNAs 的深度測(cè)序結(jié)果，挖掘了多個(gè)miRNAs，如miR-5110[9]、lpa-miRnov-66[10]、miR-508-3p[11]?；趯?shí)驗(yàn)室前期的研究，筆者發(fā)現(xiàn)miR-7081-5p 在白色和棕色羊駝皮膚中呈差異表達(dá)，推測(cè)miR-7081-5p可能參與毛色的形成[4]。

利用生物信息學(xué)工具，預(yù)測(cè)SOX6 是miR-7081-5p 的靶基因之一。SOX 家族包含20 個(gè)基因[12]，分為8 組，命名為SOXA 到SOXH。在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中，SOX6、SOX5 和SOX13 一起屬于SOXD 組[13]。SOX10通過(guò)激活靶基因MITF，TYR，TYRP1和TYRP2調(diào)控黑色素細(xì)胞內(nèi)色素的生成[14]。SOX5 與SOX10 反應(yīng)元件相結(jié)合可以調(diào)控人黑色素瘤細(xì)胞內(nèi)MITF 的表達(dá)[15]。作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，SOX 蛋白的表達(dá)受許多信號(hào)通路的調(diào)控[16-17]。它們的轉(zhuǎn)錄活性受翻譯后修飾和隔離機(jī)制的影響[18]。在脂肪形成中，SOX6 通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路促進(jìn)β-catenin的降解[19]，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路參與黑色素生成[9]，因此推測(cè)SOX6可能在黑色素生成中具有重要的作用。

SOX6 是一個(gè)核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，SOX6 和SOXD 家族成員（例如SOX5 和SOX13）通過(guò)各種機(jī)制充當(dāng)正轉(zhuǎn)錄或負(fù)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子[20]。SOX5 和SOX6 與黑色素細(xì)胞中的SOXE 基因可以共表達(dá)[21]。之前研究表明SOX6 通過(guò)調(diào)節(jié)CyclinD1基因在黑色素生成中起到激活劑的作用[5]。最新研究表明，SOX6 可以直接調(diào)控MITF 的表達(dá)[22]。MITF 在黑色素細(xì)胞的發(fā)育中具有重要的作用[23]，可以調(diào)控黑色素細(xì)胞的分化和黑色素生成酶的轉(zhuǎn)錄，包括TYR、TYRP1 和TYRP2[24]。本試驗(yàn)中miR-7081-5p 通過(guò)靶向SOX6，引起黑色素生成關(guān)鍵基因MITF 的表達(dá)降低，進(jìn)而下調(diào)了TYR、TYRP1 和TYRP2 的表達(dá)，最終導(dǎo)致黑色素含量的降低。一個(gè)miRNA 會(huì)有多個(gè)靶基因，miR-7081-5p 是否還會(huì)通過(guò)其他與黑色素生成有關(guān)的基因調(diào)控黑色素含量有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)的研究結(jié)果也為進(jìn)一步研究miR-7081-5p 在黑色素生成中的作用提供了理論基礎(chǔ)。