克氏原螯蝦核糖體蛋白S24(RPS24)基因的克隆與表達(dá)分析

江紅霞，李屹錚，張 冉，王 磊，張 猛，于 淼，喬志剛，李學(xué)軍

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)動物疾病控制河南省工程實驗室，河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，河南新鄉(xiāng) 453007)

克氏原螯蝦(Proambausclarkii)，隸屬于節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)十足目(Decapoda)螯蝦科(Cambaridae)原螯蝦屬(Procambarus)，是我國重要的淡水蝦類養(yǎng)殖品種?？耸显r整體產(chǎn)業(yè)在我國具有非常重要的經(jīng)濟地位，據(jù)中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒(2020)數(shù)據(jù)顯示，2019年，全國克氏原螯蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到208.960 4萬t，在淡水甲殼動物養(yǎng)殖中位居第一[1]。隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，規(guī)?；B(yǎng)殖場需要在同一時期內(nèi)提供規(guī)格整齊的苗種，因此，如何促進克氏原螯蝦卵巢同步發(fā)育并提高其抱卵量已成為克氏原螯蝦規(guī)?；B(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中重要的研究課題。

目前，在水產(chǎn)甲殼動物的規(guī)?；庇?，廣泛應(yīng)用人工摘除雌性蝦蟹的眼柄的方法來促進卵巢的同步發(fā)育、快速成熟并提高抱卵量。但眼柄摘除會使親蝦親蟹的卵巢因失去性腺抑制激素的調(diào)控而始終處在旺盛的發(fā)育狀態(tài)，后期卵巢發(fā)育成熟和排卵的速度過快，致使卵黃積累不足，卵子質(zhì)量降低，生產(chǎn)的蝦蟹苗容易死亡。同時眼柄摘除手術(shù)對親蝦親蟹的損傷較大，死亡率也較高[2]。因此，尋找新的人工調(diào)控方法成為其規(guī)模化繁育中亟待解決的問題。

核糖體是有機體細(xì)胞中合成蛋白質(zhì)的機器，而核糖體蛋白(ribosomal protein，RP)是組成核糖體的重要成分。但是合成蛋白質(zhì)傳遞遺傳信息并不是RP的唯一功能，它們還具有強大的核糖體外功能[3-6]。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)RP還參與許多生物體卵巢的發(fā)育過程，例如，在海膽(Paracentrotuslividus)卵子發(fā)生過程中，核糖體蛋白S24(RPS24) mRNA表達(dá)量增加[7]；核糖體蛋白L10a(RPL10a)和核糖體蛋白S3a(RPS3a)在墨吉明對蝦(Fenneropenaeusmerguiensis)卵巢發(fā)育過程中起著刺激因子的作用[8-10]；對虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的研究表明RPL10a基因在虹鱒魚染色質(zhì)核仁期和周邊核仁期的卵巢中高表達(dá)，證明該基因在虹鱒魚卵巢發(fā)育的早期進程中起重要的作用[11]；核糖體蛋白L24(RPL24)基因在日本囊對蝦(Marsupenaeusjaponicas)所有器官中的表達(dá)量以在卵巢中為最高，表明RPL24在十足目甲殼動物的卵子發(fā)生和卵巢發(fā)育中也具有重要的作用[12]。

目前，有關(guān)克氏原螯蝦卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵的調(diào)控的研究已有不少報道[13-17]，但有關(guān)核糖體蛋白在該蝦卵巢發(fā)育過程中的調(diào)控作用的研究迄今為止尚未見報道。本研究從克氏原螯蝦的卵巢中克隆得到一種核糖體蛋白S24(RPS24)基因的全長cDNA序列，命名為PcRPS24基因。對該基因的cDNA序列進行了生物信息學(xué)分析，并對該基因在克氏原螯蝦的不同發(fā)育階段、成蝦的不同的組織和不同發(fā)育時期的卵巢中的表達(dá)模式進行了檢測，以期為克氏原螯蝦卵巢同步發(fā)育的調(diào)控研究提供一定的基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

試驗用蝦來自河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，養(yǎng)殖水溫20～25 ℃，每天早晚各投喂商品飼料1次，1周換水1次。采集克氏原螯蝦不同發(fā)育階段的樣品，即無節(jié)幼體期、蚤狀幼體期的受精卵，出膜后5 d和15 d的尚不能分辨雌雄的整只蝦樣品，出膜后30 d、60 d和100 d的能分辨雌雄的雌蝦的頭胸甲樣品，以及卵巢發(fā)育至Ⅰ期的成年雌蝦的頭胸甲樣品；卵巢發(fā)育處于Ⅰ期的成年雌性克氏原螯蝦的不同組織樣品，即卵巢、肝胰腺、心臟、胃、腸、腦、眼柄、肌肉、鰓和腹神經(jīng)索共10種組織；以及成年雌蝦的Ⅰ-Ⅵ期的不同發(fā)育階段的卵巢樣品(Ⅰ期：卵原細(xì)胞增殖期；Ⅱ期：卵黃發(fā)生前期；Ⅲ期：初級卵黃發(fā)生期；Ⅳ期：次級卵黃發(fā)生期；Ⅴ期：成熟期；Ⅵ期：恢復(fù)期)。每種試驗樣品采集6尾蝦為1組，樣品獲得后立即放入RNAstore Reagent(天根，北京)中，并于-80 ℃冰箱保存，直到進行RNA的提取。

1.2 PcRPS24基因cDNA序列全長的獲得

按試劑盒Total RNA kit Ⅱ(Omega公司)的說明書對克氏原螯蝦卵巢組織提取總RNA。利用NanoDrop 2000c微量紫外分光光度計(Thermo，美國)測定RNA的濃度和純度，并利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。然后按primeScriptTMRT Master Mix試劑盒(TaKaRa，大連)的說明書合成第一鏈cDNA。根據(jù)本實驗室克氏原螯蝦轉(zhuǎn)錄組測序中得到的PcRPS24基因片段設(shè)計中間片段引物：PcRPS24-F和PcRPS24-R(表1)，以克氏原螯蝦卵巢cDNA作為模板進行PCR擴增，獲得PcRPS24基因的中間片段序列，PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，36 個循環(huán)，終延伸72 ℃ 10 min。在已獲得的中間片段序列的基礎(chǔ)上設(shè)計3′ RACE和5′ RACE的特異性引物PcRPS24-3′-GSP和PcRPS24-5′-GSP(表1)，采用SMARTer?RACE 5′/3′ Kit(Clontech公司)試劑盒，利用試劑盒中的通用引物(universal primer，UMP)和設(shè)計的3′ RACE和5′ RACE特異性引物分別擴增目的基因的3′和5′末端序列，反應(yīng)程序按照試劑盒的說明書設(shè)定。PCR擴增產(chǎn)物回收純化、連接轉(zhuǎn)化后挑選陽性克隆送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。將所獲得的中間片段序列、3′和5′端序列拼接后獲得PcRPS24基因cDNA全長序列。

1.3 序列對比分析

使用在線軟件對PcRPS24進行序列分析，包括開放閱讀框的預(yù)測(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)、蛋白的理論相對分子質(zhì)量以及理論等電點的預(yù)測(http://web.expasy.org/compute_pi/)、蛋白的磷酸化位點預(yù)測(http://www.dabi.temple.edu/disphos/)和蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(https://swissmodel.expasy.org/interactive)等。應(yīng)用ClustalX 2程序進行氨基酸多重序列比對(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/)，應(yīng)用MEGA 5.0軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.4 PcRPS24的mRNA表達(dá)模式分析

PcRPS24基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育時期、成蝦的不同組織和不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)模式利用實時熒光定量PCR(QPCR)法進行。首先按試劑盒Total RNA kit Ⅱ(Omega公司)的說明書對克氏原螯蝦的不同樣品提取總RNA。RNA的濃度、純度和完整性的檢測同1.2。使用PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa，大連)試劑盒對組織的總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。依據(jù)已克隆的PcRPS24基因cDNA全長序列設(shè)計熒光定量引物PcRPS24-qf和PcRPS24-qr，以18S-RNA為內(nèi)參基因(表1)。使用CFX96 實時熒光 PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)和SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa，大連)試劑進行QPCR，反應(yīng)體系(25 μL)：SYBR?Premix Ex Taq II 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL；反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個重復(fù)，依據(jù)2-ΔΔCt法分析實驗樣本PcRPS24的相對表達(dá)量，SPSS 20.0軟件One-Way ANOVA統(tǒng)計分析所得的數(shù)據(jù)，進行LSD和Duncan氏比較，以P<0.05作為具有顯著性差異，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)表示。

2 結(jié)果

2.1 PcRPS24基因cDNA全長和氨基酸序列分析

所克隆序列經(jīng)測序和拼接，結(jié)果顯示PcRPS24基因cDNA序列全長438 bp，其中5′非編碼區(qū)長15 bp，3′非編碼區(qū)長60 bp，poly(A)尾前有1個加尾序列AATAAA。該基因開放閱讀框408 bp，編碼136個氨基酸，推導(dǎo)的蛋白分子質(zhì)量為15.686 ku，理論等電點為10.61，分子式為C695H1172N210O189S6，富含賴氨酸(Lys，17.6%)、甘氨酸(Ala，10.3%)、天冬氨酸(Arg，10.3%)和蘇氨酸(Thr，10.3%)，含量最低的為半胱氨酸(Cys，0.7%)和組氨酸(His，0.7%)。另外，在該氨基酸序列上預(yù)測到有11個磷酸化位點，為1個絲氨酸(Ser)和10個蘇氨酸(Thr)(圖1)，另外還有一個RPS24e 標(biāo)志序列。

圖1 PcRPS24基因全長cDNA序列和氨基酸序列分析Fig.1 Sequence analysis of the full-length cDNA and amino acid of PcRPS24ORF區(qū)的起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)用紅色標(biāo)注，橢圓形內(nèi)為預(yù)測的磷酸化位點，下劃線部分為RPS24e 標(biāo)志序列，長方形框內(nèi)為poly A加尾信號(AATAAA)

2.2 PcRPS24氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)進化分析

利用NCBI BLASTP軟件，將克氏原螯蝦與其他已知動物的RPS24氨基酸序列進行同源性比對。結(jié)果顯示克氏原螯蝦與其他已知動物的RPS24氨基酸序列相似性在72%～80%，其中與脊椎動物硬骨魚綱的八棘多刺魚的相似性最高，為79.84%，其次為黃鰭棘鯛和虹鱒，相似性均為79.07%，與無脊椎毛顎動物頭翼鋤蟲的相似性最低，為72.41%(表2)。利用Expasy 在線軟件預(yù)測了PcRPS24蛋白的三維結(jié)構(gòu)，該蛋白具有5個α-螺旋和4個β-折疊結(jié)構(gòu)(圖2)。使用Clustal X2將克氏原螯蝦與其他已知節(jié)肢動物的RPS24氨基酸序列進行多重比對，發(fā)現(xiàn)所有已知節(jié)肢動物的RPS24均具有5個α-螺旋區(qū)和4個β-折疊區(qū)，以及一個RPS24e標(biāo)志序列，其氨基酸序列結(jié)構(gòu)見圖3。利用MEGA 5.0構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，RPS24進化分析發(fā)現(xiàn)，進化樹分為兩大支，脊椎動物聚為一支，無脊椎動物聚為一支，克氏原螯蝦的RPS24與無脊椎動物昆蟲綱動物的RPS24聚為一支，親緣關(guān)系最近，而與陸生脊椎動物的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4)。

表2 克氏原螯蝦與其他動物的RPS24氨基酸序列的同源性比對Tab.2 Comparative identity of amino acid sequence of RPS24 between P.clarkii and other animals

圖2 預(yù)測的PcRPS24蛋白三維結(jié)構(gòu)圖Fig.2 The predicred three-dimensiona structure of PcRPS24

圖3 克氏原螯蝦RPS24與其他節(jié)肢動物RPS24氨基酸序列比對Fig.3 Alignment of RPS24 in P.clarkii with those of other known arthropodas使用Clustal X進行多重序列比對，綠色框內(nèi)為α-螺旋區(qū)，紅色框內(nèi)為β-折疊區(qū)，桔色框內(nèi)為RPS24e 標(biāo)志序列

圖4 基于RPS24氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹(Neighbor-Joining 法)Fig.4 Phylogenetic tree based on amino acid sequences of RPS24(Neighbor-Joining method)線的長度與遺傳距離成正比，克氏原螯蝦用“▲”表示

2.3 PcRPS24 基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育時期的表達(dá)模式

PcRPS24基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育時期的表達(dá)模式如圖5所示。從無節(jié)幼體期開始PcRPS24基因的表達(dá)水平逐漸升高，在出膜后30 d時與在出膜后15 d時相比略微下降，然后又繼續(xù)升高，在卵巢發(fā)育至Ⅰ期的成蝦時達(dá)到最大值。卵巢發(fā)育至Ⅰ期的成蝦時和出膜后100 d時的PcRPS24基因表達(dá)水平無顯著差異，但均顯著高于無節(jié)幼體期、溞狀幼體期、出膜后5、15、30和60 d時的表達(dá)水平。

圖5 PcRPS24基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育時期的表達(dá)模式Fig.5 Expression pattern of PcRPS24 gene in the development period of P.clarkii1.無節(jié)幼體；2.溞狀幼體；3.出膜后5 d；4.出膜后15 d；5.出膜后30 d；6.出膜后60 d；7.出膜后100 d；8.卵巢發(fā)育至Ⅰ期的成蝦。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 PcRPS24 基因的組織表達(dá)模式

PcRPS24 基因在成體克氏原螯蝦不同組織中的表達(dá)模式見圖6。結(jié)果顯示PcRPS24基因在所檢測的10個組織中均有表達(dá)，但在肝胰腺中的相對表達(dá)量最高，其次為卵巢、肌肉、鰓和腦，這五個組織中的PcRPS24 基因表達(dá)量沒有顯著差別。腹神經(jīng)索中PcRPS24 基因表達(dá)量最低。PcRPS24在肝胰腺和卵巢中的基因表達(dá)量顯著高于心臟、胃、腸、眼柄和腹神經(jīng)索，心臟、胃、腸、眼柄和腹神經(jīng)索這五個組織中的PcRPS24 基因表達(dá)量沒有顯著差別。

圖6 PcRPS24基因在成年克氏原螯蝦各組織中的表達(dá)模式Fig.6 Expression pattern of PcRPS24 gene in different tissues of adult P.clarkii1.卵巢；2.肝胰腺；3.心臟；4.胃；5.腸；6.腦；7.眼柄；8.肌肉；9.鰓；10.腹神經(jīng)索。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.5 PcRPS24 基因在不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)模式

在克氏原螯蝦不同發(fā)育階段的卵巢中均檢測到PcRPS24基因的表達(dá)(圖7)，PcRPS24基因的表達(dá)量在Ⅰ期卵巢中最高，然后隨著卵巢的發(fā)育先逐漸下降，在Ⅳ期卵巢中又升高，隨后在Ⅴ期和Ⅵ期卵巢又下降，并在Ⅴ期卵巢中的表達(dá)量達(dá)到最低值。Ⅰ期卵巢中PcRPS24基因的表達(dá)量和Ⅱ期卵巢無顯著差異，但顯著高于Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期卵巢中PcRPS24基因的表達(dá)量。

圖7 PcRPS24基因在不同發(fā)育時期的卵巢中的表達(dá)模式Fig.7 Expression pattern of PcRPS24 gene in different ovarian stages of P.clarkiiⅠ～Ⅵ：Ⅰ～Ⅵ期卵巢；不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

核糖體蛋白具有蛋白質(zhì)合成功能之外的其他作用，即核糖體外作用[18]。RPS24為核糖體40S小亞基的一個組成部分，對于RPS24基因的研究，目前多集中在RPS24基因異常表達(dá)與哺乳動物DBA先天性再生障礙性貧血[19-21]及癌癥發(fā)生[22-24]的關(guān)系方面，而RPS24 基因與生物體卵巢發(fā)育的關(guān)系的研究則十分有限[7]。

本研究克隆得到了RPS24 基因的cDNA 的全長序列PcRPS24基因。PcRPS24與其他已知節(jié)肢動物的RPS24氨基酸序列進行多重比對后發(fā)現(xiàn)，這些動物RPS24的氨基酸序列均具有5個α-螺旋區(qū)和4個β-折疊區(qū)，以及一個RPS24e 標(biāo)志序列，說明節(jié)肢動物的RPS24蛋白可能具有相似的結(jié)構(gòu)和功能。目前，已知動物的RPS24 mRNA前體可經(jīng)選擇性剪接產(chǎn)生4種轉(zhuǎn)錄本RPS24a、RPS24b、RPS24c和RPS24e，克氏原螯蝦和已知的節(jié)肢動物的RPS24氨基酸序列上均具有一個RPS24e 標(biāo)志序列，說明他們都應(yīng)該屬于RPS24e。RPS24系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦的RPS24與無脊椎動物昆蟲綱的RPS24聚為一支，這與克氏原螯蝦與昆蟲動物都屬于節(jié)肢動物門的分類地位是一致的。

在克氏原螯蝦的發(fā)育過程中，本研究發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)育時間的延長，PcRPS24 基因的表達(dá)量有逐漸增加的趨勢，并在卵巢發(fā)育至Ⅰ期的成蝦時達(dá)到最大值。克氏原螯蝦在出膜后30 d后可以分辨雌雄，本實驗對雌蝦發(fā)育的研究結(jié)果說明隨著卵巢的分化和逐步發(fā)育，雌蝦對PcRPS24蛋白的需要量是逐漸增加的。在雌性克氏原螯蝦成蝦的各組織中，PcRPS24在卵巢中的表達(dá)量也高于除了肝胰腺之外的其他8種組織，表明PcRPS24蛋白在克氏原螯蝦的卵巢中可能起著重要的作用。

對PcRPS24基因在克氏原螯蝦不同發(fā)育階段的卵巢中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，該基因的表達(dá)量在Ⅰ期卵巢中最高，然后隨著卵巢的發(fā)育逐漸下降，在Ⅳ期卵巢中又升高，隨后又下降，并在Ⅴ期卵巢中達(dá)到最低值。卵巢的發(fā)育過程伴隨著卵子的發(fā)生、發(fā)育和成熟。在克氏原螯蝦Ⅰ期到Ⅱ期卵巢的發(fā)育中，其主要事件為卵原細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞，在Ⅰ-Ⅲ期的卵巢中，伴隨著卵原細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞的發(fā)育，PcRPS24的表達(dá)量逐漸下降。在Ⅳ期到Ⅴ期卵巢發(fā)育中，其主要事件為卵母細(xì)胞成熟分裂的啟動，在Ⅳ期卵巢中，PcRPS24的表達(dá)量伴隨著卵母細(xì)胞成熟分裂的啟動突然增高，但在Ⅴ期和Ⅵ期卵巢中，伴隨著卵子的成熟和排出，PcRPS24的表達(dá)量又逐漸下降，并在Ⅴ期卵巢中降至最低。據(jù)此推測PcRPS24在克氏原螯蝦卵巢中的功能可能與卵原細(xì)胞分化為卵母細(xì)胞和卵母細(xì)胞成熟分裂的啟動這兩個關(guān)鍵點有關(guān)。由于該基因的表達(dá)量在Ⅰ期卵巢中最高，推測PcRPS24在早期卵巢發(fā)育過程中的卵原細(xì)胞的分化中可能起最重要的作用。Navakanitworakul等[8]在研究墨吉明對蝦時發(fā)現(xiàn)，RPS3a基因在該蝦卵巢發(fā)育的早期階段表達(dá)量最高，然后隨卵巢的發(fā)育是逐漸降低；Palasin等[9]的研究發(fā)現(xiàn)RPL10a蛋白能刺激墨吉明對蝦早期卵巢的發(fā)育，但對晚期卵巢不起作用；這兩項研究認(rèn)為RPS3a和RPL10a這兩種核糖體蛋白都在墨吉明對蝦卵巢發(fā)育的早期階段起重要的作用，可能是早期卵巢發(fā)育的刺激因子，這與本實驗對PcRPS24的研究結(jié)果基本一致。然而，Sgroi等[7]在研究海膽卵子發(fā)生過程中，發(fā)現(xiàn)RPS24 mRNA 表達(dá)量隨卵子的發(fā)育是逐漸增加的，這與本研究結(jié)果不一致，這可能與物種的不同有關(guān)，但由于RPS24在不同動物卵巢和卵子發(fā)育過程中的作用的研究非常有限，具體原因尚需進行大量的不同物種的比較研究才能進一步確定。

總之，本研究克隆獲得了PcRPS24基因 cDNA 序列全長，通過生物信息學(xué)分析以及系統(tǒng)進化分析了解了該基因的序列特征和進化特點，通過熒光定量分析推測該基因的功能可能與克氏原螯蝦卵原細(xì)胞的分化和卵母細(xì)胞成熟分裂的啟動有關(guān)，并可能在克氏原螯蝦卵巢早期發(fā)育階段中起最重要的作用。