昆明裂腹魚潰瘍病病原菌分離鑒定及藥物敏感性

張桓橋，商寶娣，趙 鳳，周賢君，張效平，李小義，孔 杰，楊 星，陶 莎

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州省水產(chǎn)研究所，貴陽 550025；3.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心，貴陽 550025；4.貴陽市水產(chǎn)技術(shù)推廣站，貴陽 550025)

昆明裂腹魚(Schizothoraxgrahami)隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)裂腹魚亞科(Schizothoracinae)裂腹魚屬(Schizothorax)，是我國特有的高原魚類，僅分布于西南地區(qū)，在貴州主要分布于金沙江下游干支流、烏江上游和南、北盤江之上游支流中[1]。昆明裂腹魚肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，為高檔食用魚，是貴州省重要的經(jīng)濟(jì)土著魚類之一[2，3]。水利工程建設(shè)以及自然棲息生境破壞導(dǎo)致野生昆明裂腹魚種群數(shù)量受到嚴(yán)重影響，2015年昆明裂腹魚被《中國脊椎動物紅色名錄》列為瀕危物種(endangered，EN)[4]。近年來，貴州省不斷加大對昆明裂腹魚開發(fā)利用的研究，主要集中在分子遺傳、人工繁殖和胚胎及幼魚發(fā)育等方面[5-8]，目前已實(shí)現(xiàn)全人工繁殖技術(shù)的突破，并在畢節(jié)市、貴陽市、安順市與銅仁市等多地進(jìn)行推廣養(yǎng)殖，取得了明顯的經(jīng)濟(jì)、社會、生態(tài)效益。

然而隨著昆明裂腹魚養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大、養(yǎng)殖水體環(huán)境的惡化與病原微生物的滋生傳播，昆明裂腹魚疾病頻發(fā)給經(jīng)濟(jì)造成了巨大損失。2012年起，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)畢節(jié)、江口等地多個(gè)養(yǎng)殖場流水養(yǎng)殖的昆明裂腹魚背鰭前后出現(xiàn)皮膚破裂、肌肉潰爛，根據(jù)其發(fā)病特征，稱為“潰瘍病”?；疾◆~主要癥狀為游動無力、食欲減弱且反應(yīng)遲鈍；頭部、背鰭部出現(xiàn)灰白色斑塊后發(fā)生潰爛，潰爛部位均較深甚至至腔；剖檢后發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)白或發(fā)黃，膽囊透亮，腸道無內(nèi)容物等。該疾病一年四季持續(xù)發(fā)生，感染率可達(dá)90%，雖然死亡率不高，但是由于病魚體表損傷嚴(yán)重，病程較長，難治愈，成為昆明裂腹魚養(yǎng)殖推廣中的一大瓶頸。

本研究于2020年9月，自患病昆明裂腹魚體表潰爛處、肝臟與腎臟均分離獲得形態(tài)大小一致的菌落，隨機(jī)選取腎臟分離細(xì)菌(BL61C)作為試驗(yàn)菌。采用形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性鑒定及16S rDNA、dnaJ、cpn60等基因的序列分析進(jìn)行病原鑒定，通過回歸感染確定其致病性，以K-B紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)測定該菌藥物敏感性，以期為昆明裂腹魚的潰瘍病診斷及臨床治療提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚及藥品

患病昆明裂腹魚取自貴州省畢節(jié)市某養(yǎng)殖場，體重(256.3±58.02)g，發(fā)病水溫(16±2)℃?；貧w感染試驗(yàn)所用昆明裂腹魚購于畢節(jié)市另一未發(fā)病養(yǎng)殖場，試驗(yàn)用魚體色正常、體表無損傷、活力較好，平均體重(250±10)g，暫養(yǎng)7 d后用于試驗(yàn)。LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、MH固體培養(yǎng)基、生理生化鑒定管及藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；PCR相關(guān)制品購自Takara生物技術(shù)有限公司；引物合成和DNA測序于上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行。

1.2 細(xì)菌分離

取具典型特征患病魚，75%酒精擦拭病魚體表后，在無菌條件下，自病魚體表潰爛處、肝臟與腎臟劃取部分組織，在LB固體培養(yǎng)基上劃線接種，置于28 ℃生化培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。觀察菌落生長情況，挑取形態(tài)特征一致的菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)。選取純化后的單克隆菌落轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，在28℃生物搖床中振蕩過夜后，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 細(xì)菌的形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定

純化菌株劃線接種于LB平板上，28℃過夜培養(yǎng)，觀察菌落的生長特性和菌落形態(tài)。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[9]，采用細(xì)菌微量生化鑒定管對待測菌株進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)的測定。

1.4 16S rDNA、dnaJ、cpn60基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

1.4.1 基因的PCR擴(kuò)增

將純化菌株BL61C接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)，經(jīng)4 000 r/min、5 min離心集菌。在收集到的菌體中加入10 μL ddH2O使其重新懸浮，經(jīng)99 ℃裂解后離心，取上清作為PCR模板。應(yīng)用細(xì)菌16S rDNA基因通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃，5 min；94℃，45 s；55℃，45 s；72℃，90 s；35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。參照李偉杰等[10]方法進(jìn)行dnaJ、cpn60基因的擴(kuò)增，擴(kuò)增條件均為94℃，3 min；94℃，30 s、55℃，30 s；72℃，1 min；35個(gè)循環(huán)；72℃，7 min。各基因擴(kuò)增所用引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primers

1.4.2 序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結(jié)果利用SeqMan、BioEdit等分析軟件拼接整理。結(jié)果上傳至NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLATS檢索，選取與目的基因同源性較高的基因，利用MEGA5.05分析軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，系統(tǒng)樹各分支的置信度由Bootstrap1 000次循環(huán)檢驗(yàn)。

1.5 回歸感染試驗(yàn)

將純化菌株BL61C接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)好的菌液經(jīng)4 000 r/min、10 min離心集菌，菌體以無菌PBS緩沖液漂洗三次并重懸，據(jù)麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)節(jié)菌懸液濃度分別為1.0×105、1.0×106、1.0×107、1.0×108和1.0×109CFU/mL。將暫養(yǎng)7 d后的健康昆明裂腹魚隨機(jī)分為6組，每組10尾，每尾腹腔注射對應(yīng)濃度菌懸液200 μL，陰性對照組注射200 μL 無菌PBS緩沖液，每組3個(gè)重復(fù)。將回歸感染后的魚置于水族箱(長600 mm×寬350 mm×高200 mm)中養(yǎng)殖，水溫保持在(16±2)℃，溶解氧保持在(6.5±1) mg/L，2 d換水一次且每次不超過原體積的1/3，不投喂餌料，試驗(yàn)周期為10 d。每24 h觀察記錄一次魚的發(fā)病癥狀和死亡情況，并對剛死亡的試驗(yàn)魚進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。通過SPSS 23.0軟件計(jì)算半數(shù)致死濃度(LC50)。

1.6 藥物敏感試驗(yàn)

選取15類43種常用抗生素，采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)測定菌株BL61C的藥物敏感性。將純化菌株BL61C接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min過夜培養(yǎng)后，調(diào)整菌懸液濃度為1.0×107CFU/mL，取400 μL菌液均勻涂布于MH培養(yǎng)基中，重復(fù)三次。待菌液吸收后，用鑷子將待測藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，于28 ℃培養(yǎng)24 h后，測量抑菌圈直徑(結(jié)果保留一位小數(shù))，據(jù)產(chǎn)品說明書判定藥敏結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 患病昆明裂腹魚癥狀及分離菌形態(tài)

觀察發(fā)現(xiàn)，病魚頭部、背鰭基部出現(xiàn)潰爛，潰爛部位均較深(圖1)；剖檢后發(fā)現(xiàn)肝臟發(fā)白或發(fā)黃，膽囊透亮，腸道無內(nèi)容物。在無菌條件下自體表潰爛處、肝臟與腎臟處分離病原菌，在LB固體培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h。分離菌株菌落形態(tài)大小一致，為表面光滑、邊緣整齊、中央隆起的直徑約1～2 mm的灰白色圓形菌落。從各組織分離菌中隨機(jī)挑取10株菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，純化培養(yǎng)后菌落形態(tài)大小也基本一致。隨機(jī)選取從腎臟分離的細(xì)菌作為試驗(yàn)菌，編號為BL61C。

2.2 細(xì)菌生理生化鑒定

分離菌株BL61C的主要理化特性為具有動力性，β-半乳糖苷酶、葡磷胨水、枸櫞酸鹽與葡萄糖發(fā)酵陽性；不發(fā)酵木糖、鼠李糖、山梨醇等；硫化氫、尿素陰性(表2)。初步確定分離菌株BL61C為維氏氣單胞菌。

表2 菌株BL61C的生理生化特性鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of biochemical characteristics of strain BL61C

2.3 分子鑒定

擴(kuò)增得到菌株BL61C的16S rDNA、dnaJ、cpn60序列長度分別為1 401 bp、883 bp和700 bp，目的序列提交GenBank核酸序列數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號分別為MW517563、MW541161、MW541162。將目的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，取與目的序列同源性較高的序列通過MEGA5.05鄰接法(Neighbor-joining，NJ)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果均顯示菌株BL61C與A.veronii聚為一支(圖2-4)，由Bootstrap1 000給出的置信度分別為100、92和92，基本確定菌株BL61C為A.veronii。

圖2 菌株BL61C基于16S rDNA序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 NJ phylogenetic tree of BL61C based on 16S rDNA sequences

圖3 菌株BL61C基于dnaJ序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 NJ phylogenetic tree of BL61C based on dnaJ sequences

圖4 菌株BL61C基于cpn60序列的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 NJ phylogenetic tree of BL61C based on cpn60 sequences

2.4 回歸感染試驗(yàn)

以不同濃度的菌懸液回歸感染健康昆明裂腹魚后，除陰性對照組以外，各分組呈現(xiàn)不同程度的死亡情況。按菌懸液濃度從高到低，1.0×109CFU/mL濃度組注射第12 h產(chǎn)生死亡，5 d累計(jì)死亡率達(dá)100%；其余4組10 d累計(jì)死亡率分別為76.67%、46.67%、33.33%、10.00%(表3)；經(jīng)計(jì)算獲得菌株BL61C對昆明裂腹魚的LC50值為5.09×107CFU/mL。除急性死亡試驗(yàn)魚以外，其余試驗(yàn)魚在感染后可見游動緩慢；1 d時(shí)試驗(yàn)魚后背鰭基部前后出現(xiàn)灰白色斑塊，有潰爛前兆；2 d后試驗(yàn)魚灰白色斑塊發(fā)生破裂，出現(xiàn)潰瘍；臨床癥狀與自然病例相似。對回歸感染后患病昆明裂腹魚進(jìn)行病原菌的再分離，經(jīng)16S rDNA鑒定發(fā)現(xiàn)，再分離菌與回歸感染菌屬同種細(xì)菌，證實(shí)菌株BL61C為昆明裂腹魚潰瘍病的致病菌。

表3 菌株BL61C回感試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Artificial infection test of BL61C

續(xù)表3

2.5 藥敏試驗(yàn)

菌株BL61C藥物敏感性見表4。結(jié)果顯示該菌對大觀霉素、阿奇霉素、氧氟沙星、氯霉素、氟苯尼考、頭孢他啶、頭孢克肟和頭孢噻肟8種藥物敏感；對慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那、紅霉素、諾氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、頭孢噻吩、頭孢哌酮、復(fù)方新諾明、甲氧芐胺嘧啶與克林霉素15種藥物中敏；對克拉霉素、制霉菌素、四環(huán)素20種藥物耐藥。對氨基糖苷類、喹諾酮類與酰胺醇類3類藥物均表現(xiàn)為中敏或敏感；對四環(huán)素類、糖肽類、香豆素類等7類均耐藥。

表4 分離株藥物敏感性結(jié)果Tab.4 The results of drug sensitivity of isolates

續(xù)表4

續(xù)表4

3 討論

3.1 維氏氣單胞菌的致病性

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)隸屬于弧菌科(Vibronaceae)氣單胞菌屬(Aeromonas)，亦被稱為維羅納氣單胞菌、凡隆氣單胞菌和維隆氣單胞菌，廣泛分布于自然界的土壤和水體中。維氏氣單胞菌感染力極強(qiáng)，可感染達(dá)氏鱘(Acipenserdabryanus)[11]、斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunetaus)[12]、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)[13]、大刺鰍(Mastacembelusarmatus)[14]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[15]等多種重要的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物。水產(chǎn)動物感染維氏氣單胞菌常表現(xiàn)出行動緩慢、攝食減少、體表潰爛、表皮出血且剖檢后可見腹腔積水、內(nèi)臟出血或肝臟腫大與腸道炎癥等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至造成死亡[16-18]。昆明裂腹魚感染維氏氣單胞菌后的癥狀以體表潰爛為主，與感染虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[19]、大口黑鱸(Micropterussalmoides)[20]后癥狀相似，但發(fā)病條件不同，這可能與環(huán)境因子、宿主抵抗力、菌株毒力等因素存在聯(lián)系，其流行規(guī)律與致病機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

3.2 維氏氣單胞菌的藥物敏感性

在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，為減少病害造成的損失抗生素被大量使用，但抗生素的誤用以及濫用容易誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列攜帶抗生素抗性基因的耐藥菌株增加防治難度，同時(shí)藥物殘留等問題也給人類的公共衛(wèi)生安全造成嚴(yán)重威脅，探究病原菌的藥物敏感性對有效使用抗生素具有重要意義[21-22]。維氏氣單胞菌的藥物敏感性已有較多研究報(bào)道，不同地域、不同品種因養(yǎng)殖模式、用藥習(xí)慣等的不同藥敏結(jié)果不盡相同[23-27]。本研究用15類43種抗生素對貴州省畢節(jié)市某養(yǎng)殖場昆明裂腹魚源維氏氣單胞菌進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，結(jié)果表明分離菌對大觀霉素、阿奇霉素、氧氟沙星、氯霉素、氟苯尼考、頭孢他啶、頭孢克肟、頭孢噻肟8種藥物敏感；對慶大霉素、鏈霉素、妥布霉素等15種藥物中敏；對克拉霉素、制霉菌素、四環(huán)素等20種藥物耐藥，與其他研究分離的維氏氣單胞菌藥物敏感性均存在一定差異。因此，在水產(chǎn)動物病害防治中不能依據(jù)經(jīng)驗(yàn)主觀地選擇治療藥物，而應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果科學(xué)、合理地用藥。