乙肝肝纖維化患者血液miR?122、miR?181a水平與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系

崔紅梅 盧坤玲 付麗坤 張利利

在我國(guó)，乙肝病毒感染是肝病的主要病因，流行病學(xué)報(bào)道，在全世界范圍內(nèi)，30%的肝硬化及45%的肝癌患者是由慢性乙型肝炎（Chronic hepa?titis B，CHB）發(fā)展而來(lái)［1］。目前認(rèn)為，肝纖維化的診斷、分期對(duì)評(píng)估慢性肝病程度及乙肝抗病毒治療具有重要指導(dǎo)意義，對(duì)于延緩肝硬化、肝癌的進(jìn)展均有積極作用［2］。當(dāng)前肝臟病理學(xué)檢查仍是肝纖維化診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但肝臟病理學(xué)診斷為創(chuàng)傷性檢查，有較大的并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［3］。microRNA 是一種廣泛存在的非編碼小RNA，對(duì)蛋白表達(dá)具有調(diào)節(jié)作用，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、代謝等多種生理學(xué)功能。miR?122 位于18q21.31 位點(diǎn)，是肝臟組織中表達(dá)量最豐富的的RNA，研究表明其在肝細(xì)胞生長(zhǎng)、脂質(zhì)代謝、病毒感染等多種生物學(xué)過(guò)程中均發(fā)揮調(diào)控作用［4］。miR?181a 是miR?181 家族成員，位于9號(hào)染色體正鏈上，研究表明miR?181 可直接靶向肝分化轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖［5］。本研究初步探討miR?122、miR?181a 對(duì)肝纖維化程度評(píng)估的價(jià)值，以期為肝纖維化病情的評(píng)估及治療提供一定參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年3月至2020年5月本院收治的186 例CHB 患者作為CHB 組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《慢性乙型肝炎防治指南》［6］，乙型肝炎表面抗原陽(yáng)性6 個(gè)月及以上；②行肝臟組織病理檢查；③對(duì)本研究知情并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①其他類型病毒性肝炎者、酒精性肝炎者；②接受抗病毒或抗纖維化治療者；③存在藥物性肝損傷者；④合并惡性腫瘤者。CHB 組患者中男性120 例，女性66 例，平均（44.88±8.52）歲。另選取本院100 例同期健康體檢者作為對(duì)照組。對(duì)照組受試者中男性66 例，女性34 例，平均（45.27±8.96）歲，兩組性別組成及年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)。

1.2 方法

血清生化檢測(cè)：對(duì)照組于體檢當(dāng)日、CHB 患者于行肝組織病理學(xué)檢查當(dāng)日采集5 mL 空腹靜脈血，抗凝后提取血清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）等肝生化指標(biāo)。

肝臟組織病理學(xué)檢查：CHB 組患者行超聲引導(dǎo)下肝臟穿刺及組織病理學(xué)檢查，標(biāo)本長(zhǎng)度>1.0 cm，至少包括6 個(gè)匯管區(qū)，參考國(guó)際Scheuer 系統(tǒng)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)［7］進(jìn)行肝纖維化分期，其中S0（25 例）、S1（44 例）、S2（35 例）、S3（52 例）、S4（30 例）。

miR?122、miR?181a 表達(dá)水平：采集患者外周空腹靜脈血，抗凝處理，采用血液RNA 提取試劑盒提取標(biāo)本中總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 轉(zhuǎn)換成cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)檢測(cè)miR?122、miR?181a 表達(dá)，內(nèi)參為U6，引物序列如下：miR?122（正向引物：5′?TGC?GCTGGAGTGTGACAATGGT?3′，反向引物：通用引物）；miR?181a（正向引物：5′?AACATTCAAC?GCTGTCGGTGAGT? 3′，反向引物：通用引物）；U6（正向引物：5′?GCTTCGGCAGCACATATACTA?AAAT?3′，反向引物：5′?CGCTTCACGAATTTGC?GTGTCAT?3′）。采用相對(duì)定量法計(jì)算表達(dá)水平，ΔCt=目的擴(kuò)增Ct 值?U6 Ct 值，以2?ΔΔCt表示為目的產(chǎn)物的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、多組間比較采用F 檢驗(yàn)；采用Pearson及Spearman相關(guān)性分析指標(biāo)間的相關(guān)性；繪制受試者特征工作曲線（ROC）分析指標(biāo)診斷價(jià)值，以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組受試者臨床資料及miR?122、miR?181a表達(dá)水平比較

CHB 組ALT、AST、TBIL 等生化指標(biāo)及miR?122、miR?181a 表達(dá)水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組受試者臨床資料及miR?122、miR?181a 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison on clinical data and expression levels of miR?122 and miR?181a between 2 groups（±s）

表1 兩組受試者臨床資料及miR?122、miR?181a 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison on clinical data and expression levels of miR?122 and miR?181a between 2 groups（±s）

組別CHB 組對(duì)照組t 值P 值n 186 100 ALT（U/L）75.48±10.71 22.41±5.28 46.575<0.001 AST（U/L）55.98±15.71 24.15±5.99 19.500<0.001 TBIL（μmol/L）19.38±4.71 10.22±3.96 16.552<0.001 miR?122 3.37±0.62 1.24±0.33 31.988<0.001 miR?181a 1.53±0.32 0.45±0.20 30.669<0.001

2.2 不同肝纖維化分期患者臨床資料及miR?122、miR?181a 表達(dá)水平比較

隨著肝纖維化分期的升高，CHB 患者ALT、AST、TBIL 等肝生化指標(biāo)及miR?181a 表達(dá)升高，miR?122 表達(dá)水平降低（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同肝纖維化分期患者臨床資料及miR?122、miR?181a 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison on clinical data and expression levels of miR?122 and miR?181a among patients with different stages of liver fibrosis（±s）

表2 不同肝纖維化分期患者臨床資料及miR?122、miR?181a 表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison on clinical data and expression levels of miR?122 and miR?181a among patients with different stages of liver fibrosis（±s）

注：與S0 期比較，aP<0.05；與S1 期比較，bP<0.05；與S2 期比較，cP<0.05；與S3 期比較，dP<0.05。

組別S0 S1 S2 S3 S4 F 值P 值n 25 44 35 52 30 ALT（U/L）48.52±8.45 55.17±10.22a 79.52±12.74ab 92.14±13.18abc 94.17±22.17ab 98.111<0.001 AST（U/L）25.16±4.71 33.96±6.82a 75.14±10.27ab 68.12±12.71abc 70.59±13.52ab 165.727<0.001 TBIL（μmol/L）13.52±3.26 13.88±4.71 21.71±5.11ab 20.96±5.26ab 26.85±6.12abd 41.205<0.001 miR?122 4.52±0.86 4.01±0.85 3.22±0.74ab 2.85±0.39abc 2.56±0.45ab 47.790<0.001 miR?181a 0.85±0.12 1.02±0.20a 1.66±0.43ab 1.98±0.40abc 1.90±0.42ab 79.990<0.001

2.3 miR?122、miR?181a 表達(dá)水平與臨床資料、肝纖維化分期的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析示，miR?122 與CHB 患者ALT、AST、TBIL、肝纖維化程度等呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），miR?181a 與肝生化指標(biāo)呈正相關(guān)（r1=0.501，r2=0.444，r3=0.370，r4=0.396，P均<0.05）。Spearman相關(guān)性分析示，miR?122與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)（P<0.05），miR?181a與肝纖維化程度呈正相關(guān)（P<0.05）。

2.4 miR?122、miR?181a 表達(dá)水平對(duì)肝纖維化程度的評(píng)估價(jià)值分析

ROC 曲線示，miR?122、miR?181a 表達(dá)水平診斷嚴(yán)重肝纖維化（S3～S4）的曲線下面積分別為0.851、0.783，當(dāng)截點(diǎn)值為3.26、1.42 時(shí)，約登指數(shù)最大（0.566、0.516）。見(jiàn)表3、圖1。

表3 miR?122、miR?181a 表達(dá)水平診斷嚴(yán)重肝纖維化（S3～S4）的價(jià)值分析Table 3 Value of miR?122 and miR?181a in the diagnosis of severe liver fibrosis（S3?S4）

圖1 miR?122、miR?181a 表達(dá)水平診斷嚴(yán)重肝纖維化（S3～S4）的價(jià)值分析Figure 1 Value of miR?122 and miR?181a in the diagnosis of severe liver fibrosis（S3?S4）

3 討論

miR?122 在肝臟組織中高度表達(dá)，約占全部miRNA 的70%。miR?122 主要由肝臟細(xì)胞釋放，研究表明，肝細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR?122 可抑制HBV DNA 的復(fù)制，降低病毒對(duì)肝細(xì)胞的損傷［8］。miR?122可抑制肝星狀細(xì)胞增殖，減少肝臟膠原的產(chǎn)生從而抑制纖維化的產(chǎn)生［9］。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，CHB 組miR?122 的表達(dá)明顯升高，這一結(jié)果與Liu 等人［10］研究結(jié)果類似。miR?181a 是一種廣泛存在于細(xì)胞中的miRNA，研究表明其在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)及程序性死亡方面發(fā)揮重要作用［11］。目前miR?181a 與肝纖維化之間的關(guān)系尚未完全闡釋清楚，推測(cè)可能與其介導(dǎo)肝臟炎癥從而影響肝纖維化進(jìn)程有關(guān)。既往有研究表明miR?181a 與巨噬細(xì)胞活化后白細(xì)胞介素?1β、腫瘤壞死因子?α、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子?β1 等炎癥因子水平呈相關(guān)關(guān)系［12］；而肝纖維化過(guò)程本質(zhì)上是胞外基質(zhì)合成及降解失衡的過(guò)程，miR?181a 可激活炎癥因子亢進(jìn)導(dǎo)致肝臟炎癥損傷，同時(shí)也可調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞活性，促進(jìn)基質(zhì)膠原降解合成的失衡，促進(jìn)肝纖維化進(jìn)程。

本研究結(jié)果顯示，不同肝纖維化水平CHB 患者中，隨著肝纖維化程度的升高，miR?122 的表達(dá)降低，且其水平與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)。分析其原因可能為miR?122 主要由肝臟細(xì)胞釋放，肝臟纖維化程度越高，肝細(xì)胞損傷范圍越大，肝細(xì)胞合成miR?122 能力降低，其抑制肝纖維化的作用減弱，肝纖維化進(jìn)展更快，兩者形成惡性循環(huán)。既往國(guó)外開(kāi)展的一項(xiàng)研究表明，與CHB 患者相比，肝硬化患者miR?122 表達(dá)量明顯降低，其表達(dá)水平與肝功能指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)［13］。國(guó)內(nèi)開(kāi)展的一項(xiàng)研究表明，隨著肝纖維化程度的升高，miR?122 表達(dá)量降低，其與HBV?DNA 載量、ALT、AST 等肝功能指標(biāo)呈正相關(guān)，而與肝纖維化程度呈負(fù)相關(guān)［14］。本研究與上述研究結(jié)果類似。本研究中CHB 患者miR?181a 表達(dá)升高，且隨著肝纖維化程度的升高，其表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，推測(cè)miR?181a 可能與HBV 感染后炎癥因子產(chǎn)生的肝臟損傷及肝纖維化進(jìn)程有關(guān)，其高表達(dá)或可促使炎癥亢進(jìn)、肝臟損傷及肝纖維化進(jìn)程。既往陳婧等人［15］開(kāi)展的一項(xiàng)研究證實(shí)CHB 患者miR?181a 表達(dá)升高，且隨著肝硬化分期的加重，整體呈現(xiàn)升高趨勢(shì)。但徐藝丹等人［16］開(kāi)展的一項(xiàng)動(dòng)物研究證實(shí)，肝臟纖維化小鼠miR?181 表達(dá)降低，且隨著分期程度升高呈下降趨勢(shì)。本研究與前者研究結(jié)果類似，兩者研究存在差異的原因可能為研究對(duì)象差異所致。

目前肝硬化前期的肝纖維化評(píng)估是逆轉(zhuǎn)肝臟病變的關(guān)鍵，組織病理學(xué)檢查是金標(biāo)準(zhǔn)，但鑒于其風(fēng)險(xiǎn)，其臨床應(yīng)用有較大的限制。本研究結(jié)果顯示提示兩者對(duì)肝硬化嚴(yán)重程度有一定參考價(jià)值。

綜上，慢性乙肝肝纖維化患者伴有miR?122、miR?181a 水平的變化，且與肝纖維化程度相關(guān)，臨床可將其作為評(píng)估纖維化程度的參考指標(biāo)。本研究局限性在于樣本量較少，未來(lái)仍有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。