脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體miR?212?3p對(duì)成纖維樣滑膜細(xì)胞的影響

賈丙申 于鵬 焦拓 李君 李明 曲國(guó)欣 紀(jì)志華 付昆

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病。臨床表現(xiàn)為滑膜慢性炎癥性增生和肥大及手足關(guān)節(jié)損傷［1］。研究證實(shí)，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast?like synovio?cytes，F(xiàn)LS）在RA 的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其增殖和侵襲能力的增強(qiáng)與RA 的發(fā)展密切相關(guān)［2?3］。因此，探究調(diào)控RA?FIS 細(xì)胞增殖和侵襲遷移的分子機(jī)制對(duì)于改善RA 至關(guān)重要。近期研究證實(shí)，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（adipose mesenchymal stem cell，ADSC）可通過(guò)改變?cè)缙谶m應(yīng)性T 細(xì)胞反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性關(guān)節(jié)炎［4］；ADSCs 分泌的外泌體能夠降低骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［5］。此外有文獻(xiàn)報(bào)道，外泌體miRNAs 在RA 中發(fā)揮重要調(diào)控作用［6］，miR?212?3p 定位于17p13.3，參與調(diào)控多種疾病的發(fā)展，且能夠抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡［7］。但鮮有文獻(xiàn)報(bào)道ADSC 外泌體對(duì)RA?FLS 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及作用。本研究將從細(xì)胞水平探究ADSC 外泌體中miR?212?3p 對(duì)RA?FLS 細(xì)胞行為的調(diào)控及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源與試劑

收集海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院骨科類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者（20 例）和健康者（20 例）血清，患者均已簽署知情同意書(shū)，并通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。人正?；ぜ?xì)胞FLS、人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞RA?FLS 和ADSCs 細(xì)胞購(gòu)于北納生物細(xì)胞庫(kù)。DMEM 和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Biological Indus?tries 公司；Lipofectamine 2000 購(gòu)于日本TaKaRa 公司；CCK?8 試劑盒購(gòu)于日本同仁公司；Transwell 小室購(gòu)買于美國(guó)Corning Incorporated 公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Promega 公司；RT?qPCR引物、antagomiR?212?3p、miR?212?3p mimics 及陰性寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；抗體均購(gòu)自美國(guó)CST 公司。

1.2 ADSCs 細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體分離

將ADSCs 細(xì)胞于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，或在培養(yǎng)液中加入antagomiR?212?3p；培養(yǎng)24 h 后收集培養(yǎng)液，4℃、800 g 離心10 min 沉淀細(xì)胞，再于12 000 g 離心20 min 清除細(xì)胞碎片。收集上清，于4℃、100 000 g 離心2 h 收集沉淀，用PBS 洗滌1 次，最后用200 μL PBS 重懸外泌體沉淀，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RA?FLS 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

RA?FLS 細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，然后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照物（NC）、miR?212?3p mimics和si?SMAD1 質(zhì)粒。分為NC 組：RA?FLS 細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；Exo 組：RA?FLS 細(xì)胞+Exo?ADSCs 共培養(yǎng)；Exo?antagomiR?212?3p 組：RA?FLS 細(xì)胞+沉默外泌體miR?212?3p 共培養(yǎng)；si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 組：敲降RA?FLS 細(xì)胞SMAD1+沉默外泌體miR?212?3p 共培養(yǎng)。

1.4 RT?qPCR

采用Trizol 法提取血清及細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；用StepOnePlus?儀進(jìn)行qPCR 反應(yīng)，以U6 作為內(nèi)參，反應(yīng)條件為：95℃30 s，95℃5 s、60℃30 s，循環(huán)40 次。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。結(jié)果采用2?ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。引物序列見(jiàn)表1。

表1 RT?qPCR 引物序列Table 1 The primer sequence for RT?qPCR

1.5 Western blotting

收集并提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，再進(jìn)行SDS?PAGE 凝膠電泳，分離目的條帶。用濕式轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉1.5 h；加入一抗（1∶1 500），4℃孵育過(guò)夜；次日，加入HRP 二抗（1∶3 000），37℃孵育1 h，加入ECL 顯色進(jìn)行凝膠成像，并用Image J 對(duì)蛋白條帶進(jìn)行定量分析。

1.6 CCK?8

將RA?FLS 細(xì)胞以每孔加入100 μL（104個(gè)/孔）接種于96 孔板，每孔再加10 μL ADSCs 細(xì)胞外泌體懸液。于檢測(cè)前1 h，每孔加入10 μL CCK?8溶液混勻，于培養(yǎng)箱中孵育1～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處的光密度（OD）值。

1.7 Transwell

將密度 為1×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液和10 μL ADSCs 細(xì)胞外泌體懸液接種于預(yù)先包被Matrigel基質(zhì)膠的Transwell 上室。下室加250 μL 含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，取出小室，棉簽擦去上室細(xì)胞，4%的多聚甲醛固定下室細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS 洗凈，干燥后置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告

根據(jù)Starbase 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miR?212?3p 與SMAD1 的結(jié)合序列，同時(shí)構(gòu)建SMAD1 突變型載體，分別將SMAD1 野生型和突變型載體與miR?212?3p、miR?NC 共轉(zhuǎn)293T 細(xì)胞。按照雙熒光素酶報(bào)告基因說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次及以上，計(jì)量數(shù)據(jù)采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成功分離ADSCs 細(xì)胞外泌體

培養(yǎng)ADSCs 細(xì)胞并分離培養(yǎng)液上清中的外泌體，透射電子顯微鏡觀察分離的外泌體（圖1A）。采用Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)外泌體特異性標(biāo)志物CD9、CD63 和CD81 均表達(dá)陽(yáng)性，而陰性標(biāo)志物CD31 未表達(dá)（外 泌體不表達(dá)CD31、CD116 和CD34 等內(nèi)皮性或造血性表面標(biāo)記物）（圖1B）。

圖1 成功分離的ADSCs 細(xì)胞外泌體Figure 1 The exosomes of ADSCs cells were successfully isolated

2.2 ADSCs 細(xì)胞外泌體抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

在48、72 h 時(shí)，Exo 組RA?FLS 細(xì)胞增殖活力較NC 組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖2A）；與NC 組相比，Exo 組遷移和侵襲能力明顯降低（P<0.05）。（圖2B 和2C）。

圖2 ADSCs 細(xì)胞外泌體抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Figure 2 ADSCs cell exosome inhibited the proliferation，migration and invasion of RA?FLS cells

2.3 ADSCs 細(xì)胞外泌體上調(diào)RA?FLS 細(xì)胞中miR?212?3p 的表達(dá)

與NC組相比，Exo組中miR?708?5p、miR?212?3p、miR?650 及miR?92a 的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（圖3A）。miR?212?3p 在RA 患者血清中的表達(dá)水平顯著低于健康組血清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（圖3B）。

圖3 ADSCs 細(xì)胞外泌體上調(diào)RA?FLS 細(xì)胞中miR?212?3p的表達(dá)Figure 3 ADSCs cell exosome upregulated the expression of miR?212?3p in RA?FLS cells

2.4 miR?212?3p 靶向下調(diào)SMAD1 的表達(dá)

與NC 組相比，miR?212?3p mimics 與SMAD1?Wt 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)293T 細(xì)胞時(shí)熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4A）；而miR?212?3p mimics 與SMAD1?Mut 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)時(shí)熒光素酶活性與NC組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。miR?212?3p過(guò)表達(dá)組中SMAD1 的表達(dá)水平顯著低于NC 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（圖4B）。

圖4 miR?212?3p 靶向下調(diào)SMAD1 的表達(dá)Figure 4 miR?212?3p targeted downregulate the expression of SMAD1

2.5 ADSCs 細(xì)胞外泌體miR?212?3p 通過(guò)SMAD1抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

與NC 組，Exo 及si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 組中SMAD1 的表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），Exo?antagomiR?212?3p 組中SMAD1 表達(dá)水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.657），見(jiàn)圖5A。與NC 組，Exo 組及si?SMAD1+Exo?an?tagomiR?212?3p 組RA?FLS 細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著降低（P<0.05），Exo?antagomiR?212?3p 組中RA?FLS 細(xì)胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)較NC 組，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖5B、圖5C 和表2和表3。CCK?8 結(jié)果顯示，處理24 h 時(shí)，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而當(dāng)處理48 h 與72 h 時(shí)，相比于NC 組，Exo及si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 組RA?FLS 細(xì)胞活力顯著降低，而Exo?antagomiR?212?3p 組中RA?FLS 細(xì)胞活力比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Table 2 Transwell experimental results（±s）

表2 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Table 2 Transwell experimental results（±s）

組別遷移細(xì)胞數(shù)/視野t 值P 值侵襲細(xì)胞數(shù)/視野t 值P 值NC 253±19 si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 207±23 Exo 159±14 15.22 0.002 126±18 16.67 0.006 Exo?antagomiR?212?3p 236±17 17.23 0.977 198±20 21.24 0.700 176±20 19.76 0.004 115±26 24.88 0.004

表3 CCK?8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Table 3 CCK?8experimental results（±s）

表3 CCK?8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果（±s）Table 3 CCK?8experimental results（±s）

組別細(xì)胞增值活力（OD450）t 值P 值si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 24 h 48 h 72 h NC 0.56±0.19 0.78±0.12 0.87±0.15--Exo 0.53±0.14 0.6±0.18 0.78±0.14 1.043 0.007 Exo?antagomiR?212?3p 0.55±0.15 0.77±0.11 0.84±0.13 1.267 0.856 0.54±0.14 0.67±0.15 0.76±0.14 1.056 0.006

圖5 ADSCs 細(xì)胞外泌體miR?212?3p 下調(diào)SMAD1 抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Figure 5 ADSCs cell exosome miR?212?3p inhibited the proliferation，migration and invasion of RA?FLS cells by downregulating SMAD1

3 討論

RA 已成為最常見(jiàn)的結(jié)締組織疾病之一。其主要病理改變?yōu)榛そM織增厚，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，間質(zhì)嚴(yán)重水腫，嚴(yán)重破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨骼，以及血管生成。RA 已成為致殘和喪失勞動(dòng)力的主要原因之一［8］。RA?FLS 細(xì)胞是參與RA 滑膜組織發(fā)展的主要細(xì)胞群，在RA 發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，有助于類風(fēng)濕血管的形成［9］。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)體外擴(kuò)增培養(yǎng)自體ADSCs 細(xì)胞及全身輸注，能夠治療自身免疫性疾病，如多發(fā)性硬化、多發(fā)性肌炎和RA 等［10］。此外有文獻(xiàn)證實(shí)，ADSCs細(xì)胞來(lái)源的外泌體在疾病發(fā)展過(guò)程中扮演著重要角色。例如，在乳腺癌細(xì)胞模型中，ADSCs 細(xì)胞外泌體通過(guò)Wnt 信號(hào)通路促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，ADSCs 細(xì)胞來(lái)源的外泌體能夠抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

研究證實(shí)，ADSCs 細(xì)胞來(lái)源的外泌體中含有豐富的miRNAs，并在疾病發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。例如，人ADSCs 細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR?NAs 是誘導(dǎo)A2780 和SKOV?3 卵巢癌細(xì)胞抗增殖信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子［12］。同時(shí)研究證實(shí)，miRNAs在RA 的發(fā)展過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。例如，miR?124a 靶向PI3K/NF?κB 通路抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖和炎性反應(yīng)［13］；miR?506 通過(guò)靶向下調(diào)TLR4抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖，且誘導(dǎo)凋亡［14］；miR?320a靶向MAPK?ERK1/2 信號(hào)通路抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖［15］。有研究報(bào)道，miR?212?3p 在RA 患者滑膜組織、血清和RA?FLS 細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR?212?3p 能夠顯著抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖［7］。本研究的結(jié)果與以前的研究結(jié)果相似，發(fā)現(xiàn)miR?212?3p 在RA 患者血清中低表達(dá)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)ADSCs 外泌體能夠通過(guò)提高RA?FLA 細(xì)胞miR?212?3p 的表達(dá)水平抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而敲降miR?212?3p 后，能夠回復(fù)ADSCs外泌體對(duì)RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。這說(shuō)明ADSCs 細(xì)胞通過(guò)分泌外泌體miR?212?3p 上調(diào)RA?FLS 細(xì)胞中miR?212?3p 的表達(dá)，進(jìn)而抑制RA?FLS 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為。

SMAD1 蛋白是SMADs 細(xì)胞質(zhì)蛋白家族重要成員，是TGF?α/SMADs 信號(hào)通路的重要遞質(zhì)。Chen 等人［16］研究表明，SMAD1 在前列腺癌中高表達(dá)，抑制SMAD1 的表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。本研究發(fā)現(xiàn)，miR?212?3p 可靶向結(jié)合SMAD1 的3′UTR；同時(shí)，回復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR?212?3p 通過(guò)靶向下調(diào)SMAD1 進(jìn)而抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR?212?3p 在ADSCs 細(xì)胞外泌體中高表達(dá)，ADSCs 細(xì)胞通過(guò)分泌外泌體miR?212?3p上調(diào)RA?FLS 細(xì)胞中miR?212?3p 的表達(dá)水平，且靶向下調(diào)SMAD1 的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制RA?FLS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。