表皮生長因子誘導性成熟前綿羊卵母細胞體外成熟的機制研究

李玉杰，王海波，潘慶杰，顏 碩，李美玉，董煥聲

（青島農業(yè)大學動物科技學院，山東青島 266109）

目前，利用幼畜體外胚胎移植技術挖掘優(yōu)秀母畜的遺傳潛力[1]，在相對較短的時間里可以獲得更多遺傳穩(wěn)定的優(yōu)良后代[2]，但由于性成熟前綿羊卵母細胞體外發(fā)育能力較低[3]，從而影響體外胚胎生產的效率。相較體內成熟而言，卵母細胞體外成熟（In Vitro Maturation，IVM）脫離了體內微環(huán)境，導致卵丘擴散不完全或核質成熟不同步等現(xiàn)象，這嚴重影響著卵母細胞的成熟質量[4]。促黃體素（LH）誘導卵巢壁層顆粒細胞表達表皮生長因子（EGF）類因子[5]，它們可以促進卵母細胞成熟、排卵等相關過程，EGF 類因子在顆粒細胞和卵丘細胞中提供了一種自分泌和旁分泌機制來調節(jié)卵母細胞生長發(fā)育的微環(huán)境[6]。性成熟后綿羊卵巢可以在LH 的周期性刺激下，促進卵巢壁層顆粒細胞表達EGF 類因子[7]。然而，綿羊在性成熟前階段卵巢壁層顆粒細胞由于缺乏促性腺激素的周期性刺激，原始卵泡處于靜息期[8]。在體內時，性成熟前階段的綿羊卵母細胞在LH 峰到來前未啟動EGF 信號[9]。因此，通過在性成熟前綿羊卵母細胞的體外成熟液中添加一定濃度的EGF 來模擬體內成熟微環(huán)境。目前，在國內尚未報道關于EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞體外發(fā)育能力的影響。本實驗旨在探究不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞卵丘擴展、第一極體排出、肌動蛋白（Actin）定位及紡錘體組裝的影響，為改善性成熟前綿羊卵母細胞體外成熟培養(yǎng)體系和探究性成熟前綿羊卵母細胞體外成熟機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 促卵泡素（FSH）、LH 為RayBiotech公司產品；雌二醇（E2）、丙酮酸鈉、EGF、透明質酸酶、Hoechest33342、聚乙烯醇（PVA）、礦物油等為Sigma 公司產品；胎牛血清（FBS）為Gibco 公司產品；DME/F-12、Medium199/EBSS 為Hyclone 公司產品；Actin-Tracker Green（肌動蛋白綠色熒光探針）為碧云天生物科技公司產品；小鼠來源的Anti-α-tubulin 為Proteintech 公司產品；山羊抗鼠 IgG DyLight?488 為Abcam 公司產品；青鏈霉素混合液、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）、TritonX-100、Tween 20 等為自索萊寶公司產品。

1.2 試劑配制 采卵液：M199 基礎培養(yǎng)基、1%青鏈霉素混合液、0.1% PVA，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4℃保存。

卵母細胞體外成熟液：M199 基礎培養(yǎng)基、1% 青鏈霉素混合液、10% FBS、10 μg/mL FSH、10 μg/mL LH、1 μg/mL E2、2 mmol/L 丙酮酸鈉、10 ng/mL EGF、100 ng/mL EGF，1 000 ng/mL EGF，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4℃保存。

配制EGF 濃度：對照組為基礎成熟液；實驗組在基礎培養(yǎng)液中添加10、100、1 000 ng/mL EGF 配成不同EGF 濃度的IVM 液，4℃保存。

1.3 卵母細胞的采集 綿羊（2～4 月齡性成熟前綿羊，1 年左右的性成熟后綿羊）卵巢均在山東省日照市東港區(qū)的綿羊屠宰場采集，采用抽吸法與切割法獲取卵母細胞，即將抽取完卵泡液的卵巢使用手術刀片對卵巢表面的卵泡進行充分地切割，使卵泡內容物流到采卵液里。在體視顯微鏡下，挑選出卵丘顆粒細胞緊密包圍和細胞質均勻的卵母細胞。用洗卵液清洗3 次后，在38.5℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中體外成熟。

1.4 卵母細胞免疫熒光染色 將已在4%多聚甲醛中固定40 min 的卵母細胞用洗滌緩沖液洗滌3 次后，在1%Triton X-100（在PBS 中）中透化40 min。再洗滌3 次后，卵母細胞與1% BSA 孵育1 h，以阻斷IgG 的非特異性結合，上述操作均在室溫下進行。對于α-微管蛋白（紡錘體）染色，卵母細胞與抗α-微管蛋白抗體在4℃孵育過夜，然后洗滌5 次，并與二抗在室溫孵育2.5 h。對于肌動蛋白染色，在室溫下用Actin-Tracker Green 染色1 h。最終，細胞核在室溫下用PI 染色30 min。然后在激光共聚焦顯微鏡下觀察樣品的熒光情況。

1.5 實驗設計

1.5.1 年齡綿羊對卵巢中卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響將取回的綿羊卵巢分為性成熟前組和性成熟后組，挑選出卵丘顆粒細胞緊密包圍和細胞質均勻的卵母細胞。用透明質酸酶去除卵丘顆粒細胞，對性成熟前組和性成熟后組的卵母細胞分別做Hochest33342 染色，統(tǒng)計2 組卵母細胞減數(shù)分裂時期，進行6 次重復實驗。

1.5.2 不同濃度 EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞的卵丘擴展率和卵母細胞第一極體排出率的影響 使用含有不同濃度 EGF（0、10、100、1 000 ng/mL）的 IVM 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)性成熟前綿羊卵母細胞24 h，依照Fagbohun 等[12]建立的主觀評分方法統(tǒng)計卵丘擴展指數(shù)，根據第一極體排出情況，統(tǒng)計第一極體排出率。將收集的卵母細胞隨機分為4 組，分別進行3 次重復。

1.5.3 不同濃度 EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞成熟過程中肌動蛋白（Actin）定位和紡錘體（Tubulin）組裝的影響 使用含不同濃度 EGF（0、10、100、1 000 ng/mL）的 IVM 培養(yǎng)基體外培養(yǎng)性成熟前綿羊卵母細胞6 h，此時大部分卵母細胞仍處于生發(fā)泡（GV）期，透明質酸酶去除顆粒細胞后，檢測肌動蛋白定位。將體外培養(yǎng)16 h 的綿羊卵母細胞，此時的卵母細胞大部分處于MI 期，用Anti-α-tubulin（檢測紡錘體組裝情況）進行細胞免疫熒光染色。為了定量熒光強度，通過執(zhí)行相同的免疫染色程序并在激光共聚焦顯微鏡上設置相同的參數(shù)，獲得卵母細胞的熒光圖像。將卵母細胞隨機分為4組，分別進行3 次重復。

1.6 統(tǒng)計分析 利用 Image J 軟件檢測卵母細胞肌動蛋白熒光強度，采用Origin 2018 和Graphpad Prism 8 完成統(tǒng)計分析和圖表繪制，使用SPASS 23.0 軟件LSD 法進行單因素方差分析，以P<0.05 作為差異顯著性的判斷標準，結果采用平均值±標準誤差表示。數(shù)據表示為至少3 個獨立實驗的統(tǒng)計結果。

2 結果

2.1 年齡對綿羊卵巢中卵母細胞減數(shù)分裂進程的影響GV 期卵母細胞，邊緣區(qū)有1 個大而圓的細胞核，其中染色質呈松散的網狀分布；生發(fā)泡破裂（GVBD）期卵母細胞，染色質凝聚，細胞核核膜破裂。如表1 和圖1所示，性成熟前綿羊卵母細胞多數(shù)處于GV 期，極少數(shù)處于GVBD 期。性成熟前綿羊卵母細胞處于GV 期的比例高于性成熟后綿羊卵母細胞（P<0.05），GVBD 期的比例低于性成熟后綿羊（P<0.05）。

圖1 Hoechst33342 標記綿羊卵母細胞的代表性圖像

表1 性成熟前后綿羊卵巢中GV 期和GVBD 期的卵母細胞減數(shù)分析

2.2 不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵丘擴展指數(shù)和第一極體排出率的影響 如圖2 所示，與0 ng/mL EGF 組相比，10 ng/mL EGF 組的卵丘擴展指數(shù)有提高趨勢，但差異不顯著，而100 ng/mL EGF 組的卵丘擴展指數(shù)顯著提高。與100 ng/mL EGF 組相比，1 000 ng/mL EGF組的卵丘擴展指數(shù)有降低趨勢，但無顯著差異。如表2所示，100 ng/mL EGF 組第一極體排出率高于其他處理組（P<0.05），10 ng/mL EGF 和1 000 ng/mL EGF 組間第一極體排出率無顯著差異。結果表明，100 ng/mL EGF 對卵母細胞核成熟有促進作用。性成熟前綿羊卵母細胞體外培養(yǎng)24 h 后的代表性圖像見圖3。

圖3 性成熟前綿羊卵母細胞體外培養(yǎng)24 h 后的代表性圖像

表2 不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞第一極體排出的影響

圖2 不同濃度EGF 處理24 h 對性成熟前綿羊卵母細胞卵丘擴展的影響

2.3 不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞質膜肌動蛋白定位的影響 如圖4 所示，沿著卵母細胞繪制截面將熒光信號進行量化，卵母細胞肌動蛋白定位正常時，肌動蛋白在質膜中分布均勻，信號較強；100 ng/mL EGF組性成熟前綿羊卵母細胞質膜肌動蛋白的正確定位率高于其他組（P<0.05）。結果表明，添加100 ng/mL EGF可促進性成熟前綿羊卵母細胞質膜肌動蛋白的正確定位。

圖4 不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞GV 期肌動蛋白定位的影響

2.4 不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞紡錘體組裝的影響 如圖5 所示，在IVM 液中添加10 ng/mL EGF和100 ng/mL EGF 時，性成熟前綿羊卵母細胞紡錘體組裝正確率分別為63.95%和68.10%，均高于0 ng/mL EGF 組（P<0.05），1 000 ng/mL EGF 組與0 ng/mL EGF組間無顯著差異。結果表明，添加10 ng/mL 和100 ng/mL EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞紡錘體的正確組裝有促進作用。

圖5 不同濃度EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞MI 期紡錘體組裝的影響

3 討 論

哺乳動物的卵母細胞減數(shù)分裂經歷細線期、合線期、粗線期后被阻滯在前期的雙線期，阻滯期從數(shù)月長達幾年或幾十年，這種阻滯在綿羊中長達數(shù)月之久，直到性成熟后，在促性腺激素作用下卵泡周期性募集，排卵前LH 峰到來以后卵母細胞才恢復第一次減數(shù)分[13]。而且也有研究表明卵母細胞在LH 波峰誘導下恢復減數(shù)分裂后，生長充分的卵母細胞在排卵前會合成并儲存大量蛋白質，為卵母細胞的后期發(fā)育提供物質基礎，而仍處于生長階段的卵母細胞未進行充分的物質儲備[14]。研究發(fā)現(xiàn)，與性成熟后綿羊卵母細胞相比，性成熟前綿羊卵母細胞在IVM 0 h 時，其GV 率顯著高于性成熟后綿羊卵母細胞，GVBD 率顯著低于性成熟后綿羊卵母細胞，此結果表明性成熟前綿羊卵母細胞可能是因為大多數(shù)仍處于生長階段，還沒有為后期發(fā)育合成必需的儲備物質，造成了體外發(fā)育能力低。Richani 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，EGF 可以響應LH 信號并在促進卵母細胞發(fā)育中有重要作用，如促進卵丘擴展、卵母細胞生長、成熟及受精后的胚胎發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，在IVM 液中添加10 ng/mL 和100 ng/mLEGF 時性成熟前綿羊卵丘細胞擴展指數(shù)有提高趨勢，而當濃度增加至1 000 ng/mL 時卵丘擴展指數(shù)有所下降。卵丘細胞擴展指數(shù)是評估卵母細胞成熟質量的重要指標，卵丘細胞擴展指數(shù)越高，卵丘細胞產生有利于卵母細胞發(fā)育的成熟因子就越高[17]，這將提高卵母細胞的體外發(fā)育能力。本研究發(fā)現(xiàn)，當在成熟液中添加10 ng/mL 和100 ng/mL EGF 后，第一極體排出率有提高趨勢，而當濃度增加至1 000 ng/mL時第一極體排出率與100 ng/mL EGF 處理組相比顯著下降，這可能因為卵丘擴展指數(shù)高增強了卵丘細胞和卵母細胞間的縫隙連接，從而激活了更多有利于卵母細胞成熟的信號通路[18]，促進細胞核成熟，當添加1 000 ng/mL EGF 時，第一極體排出率下降，可能因為卵丘擴展指數(shù)的降低抑制了卵丘細胞向卵母細胞傳遞成熟信號。

除了卵丘細胞狀態(tài)可判斷卵母細胞成熟及質量外，DNA、RNA、蛋白質和其他必需物質的準備對于哺乳動物卵母細胞在GV 階段恢復減數(shù)分裂也至關重要[19]。肌動蛋白是細胞骨架微絲的主要成分，它通過為細胞器的移動和染色體分離提供驅動力來介導真核卵母細胞的減數(shù)分裂活性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，成熟液中未添加EGF 時，性成熟前綿羊卵母細胞GV 期卵母細胞的肌動蛋白有定位失敗的現(xiàn)象。Wang 等[21]報道，肌動蛋白細絲是細胞骨架網絡的一個重要組成部分，它的動態(tài)變化在卵母細胞紡錘體定位、成熟和受精中起著至關重要的作用，所以當GV 期卵母細胞的肌動蛋白定位失敗時會影響卵母細胞的后期發(fā)育能力。因此，本研究通過添加一定濃度的EGF 來驗證EGF 是否可以幫助性成熟前綿羊卵母細胞肌動蛋白的正確定位，從而幫助卵母細胞提高體外發(fā)育能力。本研究結果顯示，在添加10 ng/mL 和100 ng/mL EGF 時，性成熟前綿羊卵母細胞在體外培養(yǎng)6 h 時肌動蛋白定位正確率顯著提高，并且當添加100 ng/mL 的EGF 時顯著修復了性成熟前綿羊卵母細胞GV 期肌動蛋白聚合失敗的現(xiàn)象，而高濃度1000 ng/mL EGF 試驗組的肌動蛋白正確定位率與100 ng/mL EGF 試驗組相比顯著降低，發(fā)現(xiàn)GV 期肌動蛋白的正確定位與第一極體排出情況呈正相關。卵母細胞減數(shù)分裂的成熟與紡錘體的準確組裝密切相關。Radek 等[22]研究表明，EGF 可以通過響應LH 信號促進微絲F-actin 的重排。而且Jo等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在減數(shù)分裂成熟過程中，紡錘體受到微絲的牽引，逐漸由細胞中心區(qū)域向一側的皮質區(qū)域移動，最后錨定在一側的皮質區(qū)，發(fā)生不對稱分裂并排出體積較小的極體。因此，本研究又進一步驗證了一定濃度的EGF 對MI 期紡錘體形態(tài)的影響。在添加10 ng/mL和100 ng/mL EGF 時，紡錘體的組裝正確率顯著高于0 ng/mL 和1 000 ng/mL EGF 組，這可能是因為0 ng/mL和1 000 ng/mL EGF 組的微絲形成受阻，從而阻止穩(wěn)定的梭形紡錘體建立和正確的同源染色體排列，造成不能擠出第一極體。但EGF 對性成熟前綿羊卵母細胞相關成熟基因表達的影響以及早期胚胎發(fā)育的作用有待進一步研究。

4 結 論

本實驗結果顯示，性成熟前綿羊卵母細胞IVM 培養(yǎng)液中添加100 ng/mL EGF 能夠提高卵母細胞核成熟率，同時可以通過幫助肌動蛋白和紡錘體的正確組織來提高性成熟前綿羊卵母細胞在體外的發(fā)育能力。