黃連解毒湯抗新型冠狀病毒肺炎的“中藥-成分-靶點(diǎn)”調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，周文婷*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)維吾爾醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011)

新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)具有較高的傳染性和人群易感性，目前全球防控形勢嚴(yán)峻，對全球公共衛(wèi)生事業(yè)造成了嚴(yán)重威脅。新型冠狀病毒(原名2019-nCoV，現(xiàn)名SARS-CoV-2)主要侵犯呼吸系統(tǒng)，表現(xiàn)為發(fā)燒、呼吸困難、乏力和咳嗽等[1]。其與SARS樣冠狀病毒在致病機(jī)制和臨床表現(xiàn)等方面有較大的相似性[2]。SARS-CoV-2可與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ(ACE2)結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞造成感染。SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞后，釋放核糖核酸(RNA)與細(xì)胞中核糖體集合，翻譯出小核糖核酸病毒的3C蛋白酶(3CLpro)[3-4]。因此ACE2和3CLpro在SARS-CoV-2的致病過程中起關(guān)鍵作用。

黃連解毒湯是純中藥制劑，由黃連、黃芩、黃柏和梔子4味中藥組成，具有清熱瀉火解毒功效，主治實(shí)熱火毒、三焦熱盛之證。研究表明，黃連解毒湯具有明顯的抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒、抗內(nèi)毒素、抗炎等作用，是治療急性感染性疾病的有效藥物[5-7]，現(xiàn)已錄入《關(guān)于印發(fā)新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》中。本研究基于ADME參數(shù)和Lipinski規(guī)則對黃連解毒湯的活性成分進(jìn)行進(jìn)一步篩選，將其活性成分作為匹配庫，以3CLpro和ACE2作為分子對接的受體，采用AutoDock分子進(jìn)行分子對接，并通過在線軟件對活性成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行基因功能及信號(hào)通路分析，為黃連解毒湯治療COVID-19的作用及機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫及分析軟件

1.1.1數(shù)據(jù)庫 中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，中藥綜合數(shù)據(jù)庫(TCMID)(http://bionet.ncpid.org/)，中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(BATMAN-TCM)(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，蛋白質(zhì)(Uniprot)數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，富集分析數(shù)據(jù)庫(DAVID6.8)(https://david.ncifcrf.gov/)，PubMed數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)(https://www.rcsb.org)。

1.1.2分析軟件 Cytoscape3.7.1軟件(https://cytoscape.org)，Schrodinger軟件(https://www.schrodinger.com)，Chemdraw16.0軟件(https://www.chemdraw.com.cn)，PyMol軟件(https://pymol.org/)，Autodock Vina1.2軟件(http://vina.scripps.edu/index.html)。

1.2基于ADME和“Lipinski 規(guī)則”評估 黃連解毒湯的4味草藥通過TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分的獲取。本研究利用“Lipinski規(guī)則”，即相對分子質(zhì)量(MW)、脂水分配系數(shù)(AlogP)、氫鍵供體數(shù)(Hdon)、氫鍵受體數(shù)(Hacc)和旋轉(zhuǎn)鍵(RBN)篩選其活性成分[8-9]。實(shí)踐表明，“Lipinski 規(guī)則”在使用上有局限性，因此5項(xiàng)原則現(xiàn)已簡化為3規(guī)則和4規(guī)則。本文以AlogP<5、Hdon<5和Hacc<10為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。為了確保黃連解毒湯成分鑒定的準(zhǔn)確性和相關(guān)性，本研究納入了西北農(nóng)林科技大學(xué)系統(tǒng)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室(陜西楊凌)的篩選標(biāo)準(zhǔn)[10]，即藥物口服生物利用度(OB)≥30和類藥性(DL)≥0.18。DL具有良好物理化學(xué)性質(zhì)及生物學(xué)特性，DL越大，成藥性就越高[11]。對于通過口服途徑給藥的藥物，OB是衡量藥物進(jìn)入人體循環(huán)系統(tǒng)有效性的重要指標(biāo)[12]。最后通過Chemical Book數(shù)據(jù)庫對上述成分以mol格式統(tǒng)一保存，在PyMol軟件以pdb格式保存。并通過AutoDock Tools 1.5.6程序以pdbqt格式保存，作為對接配體。

1.33CLpro受體的前處理及分子對接 采用AutoTools把2019-nCoV-Mpro(PDB ID：6LU7)和ACE2(PDBID:1R42)晶體結(jié)構(gòu)蛋白以pdbqt為文件保存(添加蛋白的四字代碼)，使用Autodock Vina軟件對配體與受體進(jìn)行對接。最后取優(yōu)勢構(gòu)象進(jìn)行分析，并用Schrodinger作圖。

1.4活性成分對應(yīng)靶點(diǎn)的預(yù)測及篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選能與2個(gè)受體具有較好結(jié)合能的活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)。并將黃連解毒湯的4味中藥、成分和對應(yīng)的靶點(diǎn)通過Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5GO基因功能和KEGG通路分析 黃連解毒湯活性成分作用靶點(diǎn)通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能和信號(hào)通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1活性成分篩選結(jié)果 黃連解毒湯的4味中藥通過TCMSP、TCMID和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫共收集到532個(gè)成分，其中黃連54個(gè)、黃芩149個(gè)、黃柏140個(gè)和梔子189個(gè)，見表1。并將成分通過以AlogP<5、Hdon<5、Hacc<10、OB≥30和DL≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩選得到53個(gè)活性成分，見表2。

表1 黃連解毒湯4味中藥的總成分

表2 黃連解毒湯活性成分的ADME篩選

2.2分子對接分析結(jié)果 一般認(rèn)為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時(shí)，能量越低，發(fā)生作用的可能性就越大[13]。根據(jù)蛋白復(fù)合物中配體的坐標(biāo)以及蛋白活性口袋進(jìn)行設(shè)置，配體設(shè)置為柔性，受體設(shè)置為剛性，見圖1。黃連解毒湯的53個(gè)活性成分通過預(yù)處理后，只保留了45個(gè)成分。為了提高篩選標(biāo)準(zhǔn)，將45個(gè)活性成分的最優(yōu)結(jié)合能與目前臨床推薦化學(xué)藥物，即洛匹那韋、利托那韋和瑞德西韋等藥物進(jìn)行對比。45個(gè)活性成分與3CLpro進(jìn)行對接，結(jié)果表明，瑞德西韋的最優(yōu)結(jié)合能(-4.9 kcal·mol-1)在3個(gè)臨床推薦化學(xué)藥物中最低，于是收集最優(yōu)結(jié)合能小于該藥物的30個(gè)活性成分。

圖1 3CLpro與原配體的三維結(jié)構(gòu)圖

通過分子對接證明黃連解毒湯的主要活性成分是否與ACE2結(jié)合。為了提高篩選標(biāo)準(zhǔn)，將45個(gè)活性成分與ACE2的最優(yōu)結(jié)合能與TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“Angiotensin-converting enzyme 2”為關(guān)鍵詞篩選得到的中藥成分葛根素結(jié)合能進(jìn)行對比。結(jié)果表明，葛根素的最優(yōu)結(jié)合能為-3.8 kcal·mol-1，于是收集最優(yōu)結(jié)合能小于該成分的11個(gè)活性成分。45個(gè)活性成分中，3CLpro和ACE2與11個(gè)活性成分結(jié)合能均較高，見表3。由表3可知，氫鍵和π-π相互作用對配體與受體的識(shí)別和穩(wěn)定性起著關(guān)鍵作用。

2.3活性成分對應(yīng)的作用靶點(diǎn)的預(yù)測及篩選結(jié)果 11個(gè)主要活性成分運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選其對應(yīng)的203個(gè)靶點(diǎn)，刪除重復(fù)靶點(diǎn)后，得到101個(gè)靶點(diǎn)。見表3。11個(gè)活性成分中穆坪馬兜鈴酰胺和黃柏酮從TCMSP數(shù)據(jù)庫中未查到其作用靶點(diǎn)，為了避免收載標(biāo)準(zhǔn)和算法不同的問題，刪去這2個(gè)成分，見圖2。由圖2可知，黃連解毒湯的4味中藥、9個(gè)活性成分和101個(gè)作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系，該多維網(wǎng)絡(luò)由116個(gè)節(jié)點(diǎn)和213個(gè)邊緣組成。HB(藍(lán)色四角形)、C(黃色八角形)和T(紅色圓形)之間的邊緣代表相互作用。節(jié)點(diǎn)的大小與度數(shù)成正比。節(jié)點(diǎn)的度(Degree)越大則其參與的生物功能越多，其生物學(xué)重要性越強(qiáng)[14]。該網(wǎng)絡(luò)中，每個(gè)活性成分平均與3.95個(gè)靶點(diǎn)相互作用，每個(gè)靶點(diǎn)平均與2.2個(gè)活性成分相互作用，因此黃連解毒湯中存在1個(gè)活性成分與多靶點(diǎn)作用，同時(shí)也存在不同活性成分共同作用于同1靶點(diǎn)的現(xiàn)象，這體現(xiàn)了中藥多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制。由圖2可知，PIK3CG(Degree=7)、Akt1(Degree=7)、PTGS1(Degree=6)和PTGS2(Degree=5)等靶點(diǎn)在多維網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地位。

圖2 中藥-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

表3 黃連解毒湯活性成分與3CLpro和ACE2的分子對接結(jié)果

2.4GO基因功能和KEGG通路分析結(jié)果 將101個(gè)作用靶點(diǎn)通過DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因生物學(xué)過程和信號(hào)通路富集分析，以系統(tǒng)地解釋黃連解毒湯抗COVID-19的作用。結(jié)果顯示，作用靶點(diǎn)涉及651條目生物過程(BP)、144條目分子功能(MF)、71條目細(xì)胞組分[15](CC)以及130條KEGG信號(hào)通路，見表4。錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)在富集分析中越小，代表富集顯著程度越高,以FDR≤0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果見表4和表5。KEGG信號(hào)通路主要包括腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路、p53信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、B細(xì)胞受體信號(hào)通路、核因子κB(NF-κB)信號(hào)通路、核苷酸結(jié)合寡聚體結(jié)構(gòu)域蛋白(NOD)樣受體信號(hào)通路11條與人體識(shí)別病原體相關(guān)的信號(hào)通路，并有產(chǎn)生炎性免疫反應(yīng)有關(guān)的信號(hào)通路，HTLV-Ⅰ感染和A型流感等病原微生物相關(guān)的信號(hào)通路以及小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌信號(hào)通路等。信號(hào)通路在富集分析中越大，表示富集顯著程度越高。

表4 黃連解毒湯有效成分的GO基因功能分析

表5 黃連解毒湯中前16個(gè)顯著富集的KEGG通路(FDR≤0.01)

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為COVID-19屬于“濕毒疫”范疇，源于感受“濕毒之邪”致病。在中醫(yī)“辨證施治”理論指導(dǎo)下，中藥在“濕毒疫”的運(yùn)用中具有獨(dú)特的優(yōu)勢[16]。本文運(yùn)用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，在黃連解毒湯活性成分ADME和Lipinski規(guī)則的基礎(chǔ)上，結(jié)合各種中藥的法定質(zhì)量控制指標(biāo)，篩選、整合、分析并建立可靠的成分庫。以COVID-19為疾病模型，構(gòu)建相應(yīng)的中藥藥理網(wǎng)絡(luò)。研究報(bào)道，在對我國各地區(qū)中醫(yī)藥診療方案進(jìn)行分析中，黃連解毒湯應(yīng)用頻次為9次[17]；近20年抗病毒中藥文獻(xiàn)研究結(jié)果顯示，黃芩和黃連2味中藥使用頻次排名前6，且黃連解毒湯被推薦用于治療邪熱壅肺型疾病[18]。

本文以瑞德西韋的結(jié)合能≤-4.9 kcal·mol-1作為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出與2019-nCoV-Mpro具有較好的結(jié)合活性的成分有30個(gè)，來自黃柏、黃芩、黃連和梔子的各有12、11、6、6個(gè)(其中包含重復(fù)的成分)。以葛根素的結(jié)合能≤-3.8 kcal·mol-1作為篩選標(biāo)準(zhǔn)得到11個(gè)活性成分。其中的黃芩素、表小檗堿、千層紙黃素A、漢黃芩素和薺苧黃酮來自黃芩，白屈菜紅堿、黃柏酮、thalifendine來自黃柏，表小檗堿、穆坪馬兜鈴酰胺、黃柏酮來自黃連，異歐前胡素和山柰酚來自梔子。這11個(gè)活性成分與2019-nCoV-Mpro具有較好的結(jié)合活性。但其是否直接作用于3CLpro，從而阻斷病毒增殖，是否直接作用于宿主細(xì)胞，提高機(jī)體免疫力，阻斷病毒侵襲，需要進(jìn)一步研究。

KEGG結(jié)果表明，與病毒最為相關(guān)的PI3K-Akt信號(hào)通路、與病毒天然免疫應(yīng)答相關(guān)的信號(hào)通路Toll樣受體信號(hào)通路及與肺部最為相關(guān)的小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌均涉及PIK3CG和Akt1，且在HB-C-T網(wǎng)絡(luò)中Degree均最大，表示其生物學(xué)重要性越強(qiáng)。此外，以上主要信號(hào)通路中PI3K-Akt 信號(hào)通路在富集分析中FDR最小，表示富集顯著程度最高。近期研究報(bào)道[19]，PI3K抑制劑對A型流感病毒感染誘導(dǎo)病毒性肺炎小鼠肺組織中一氧化氮(NO)生成和炎癥反應(yīng)具有抑制作用。對活性成分而言，黃連解毒湯主要活性成分山柰酚和黃芩素均作用于PIK3CG和Akt1。黃芩素通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)人肺癌細(xì)胞A549耐順鉑株細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及抑制抗凋亡蛋白表達(dá)[20]。此外，山柰酚通過減輕氧化應(yīng)激以及顯著降低支氣管肺泡灌洗液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6 (IL-6)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)等炎癥因子，抑制NF-κB信號(hào)通路，從而對病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠產(chǎn)生保護(hù)作用[21]。進(jìn)一步推測，黃連解毒湯活性成分是否作用于PIK3CG和Akt1，減輕氧化應(yīng)激和炎癥作用，從而起到輔助治療COVID-19的作用。缺氧信號(hào)是人類腫瘤病毒編碼的毒蛋白可篡改的宿主細(xì)胞，可分為缺氧微環(huán)境應(yīng)激和缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)信號(hào)，兩者在致病過程中相輔相成、密不可分[22]。研究報(bào)道，千層紙黃素A抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和遷移[23]。并且在低氧微環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)增高具有促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的增殖及血管生成的潛能[24]，而千層紙黃素A通過抑制HIF-1α可以預(yù)防疾病[25]。千層紙黃素A是否調(diào)控腫瘤病毒介導(dǎo)的缺氧信號(hào)，從而治療小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌的作用需要進(jìn)一步研究。此外，除了以上主要活性成分以外的其他活性成分研究報(bào)道較少，需要進(jìn)一步研究。鑒于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接的限制性，需要開展實(shí)驗(yàn)研究，為黃連解毒湯抗COVID-19的作用以及后期的藥物開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。