人參皂苷Rb1治療性給藥的抗癲癇作用及機制研究

陳 雪，張慧明，馬 青，徐 夢，李 娟，柳鈺書，劉 瀅，王 茜，唐民科

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488)

癲癇是反復發(fā)作的慢性神經系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制復雜[1]。研究表明，中樞神經系統(tǒng)興奮與抑制的失衡是癲癇發(fā)作的主要機制，而谷氨酸代謝異常是造成中樞神經系統(tǒng)興奮與抑制失衡的重要原因[2-3]。谷氨酸(Glu)是中樞神經系統(tǒng)中最主要的興奮性氨基酸類神經遞質，由谷氨酸-谷氨酰胺(Glu-Gln)循環(huán)代謝調節(jié)[4]。由于細胞外缺少Glu代謝失活的途徑，當Glu被釋放至突觸間隙后，主要由星形膠質細胞上的Glu轉運體攝取進入星形膠質細胞，繼而由細胞內谷氨酰胺合成酶(GS)轉化為谷氨酰胺(Gln)，再被轉運回神經元內作為合成神經遞質的原料，即Glu-Gln循環(huán)[5]。

人參皂苷Rb1是人參的主要活性成分之一。研究發(fā)現(xiàn)，將人參皂苷Rb1預防性給藥，即邊造模邊給藥，具有抗實驗性癲癇作用[6-7]。因此，人參皂苷Rb1治療性給藥對癲癇的影響值得進一步探討。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rb1能上調Glu-Gln循環(huán)上谷氨酸轉運體1(GLT-1)和GS的表達，并具有腦保護作用。本研究采用戊四唑(PTZ)點燃方法建立癲癇模型，造模成功后，給予人參皂苷Rb1干預，探討人參皂苷Rb1治療性給藥的抗癲癇作用，并基于Glu-Gln循環(huán)關鍵酶，探討其作用機制，為臨床應用提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 JA1103N型精密天平(上海民橋精密科學儀器有限公司)；5811型低溫高速離心機(Eppendorf公司)；Epoch酶標儀(BioTek公司)；TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；超微量紫外可見分光光度計(Thermo Scientific公司)；StepOne Plus 實時定量 PCR 儀(Applied Biosystems公司)；PowerPac穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和734BR2920型凝膠成像儀，均購自Bio-Rad公司；正置熒光顯微鏡[尼康儀器(上海)有限公司]。

1.2試藥 人參皂苷Rb1(成都曼思特生物科技有限公司，批號MUST-19060116，質量分數(shù)≥98%)；丙戊酸鈉(VPA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號S161023)；戊四唑(PTZ，上海源葉生物科技有限公司，批號S48261)；谷氨酸轉運體2 (GLT-1) 兔抗鼠多克隆抗體(Abcam公司，批號ab205248)；谷氨酰胺合成酶 (GS) 兔抗鼠多克隆抗體(Proteintech公司,批號11037-2-AP)；SteadyPure通用型RNA提取試劑盒(批號AG21017)、SYBR Green Pro Tap HS預混型qPCR試劑盒(批號AG11701)和Evo M-MLV反轉錄試劑預混液(批號AG11706)，均購自艾科瑞生物科技有限公司；谷氨酸 (Glu)試劑盒 (批號A074-1-1) 和谷氨酰胺合成酶 (GS) 測定試劑盒(批號A047-1-1)，均購自南京建成生物工程研究所；BAC蛋白含量檢測試劑盒(凱基生物科技有限公司，批號KGPBCA)。

1.3實驗動物 ICR小鼠108只，雄性，體質量為18～22 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號:SCXK (京) 2016-0006。

1.4倫理審查 本研究由北京中醫(yī)藥大學醫(yī)學與實驗動物倫理委員會審核通過。動物實驗方案設計合理，實驗方法和目的符合人類的道德倫理標準和國際慣例，批準編號：BUCM-4-2020112004-4090。

2 方法

2.1癲癇小鼠模型的建立 采用PTZ點燃的方法 建立癲癇小鼠模型[8]。動物適應性飼養(yǎng)3 d，隨機分為正常組(18只)和造模組(90只)。造模組以35 mg·kg-1腹腔注射PTZ，正常組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，2 d 1次，每次造模均于固定時間進行。根據(jù)Racine分級表評價每只小鼠的癲癇發(fā)作級別，連續(xù)3次注射PTZ后，小鼠癲癇發(fā)作為4～5級，則視為點燃成功。小鼠腹腔注射PTZ 共11次，剔除第11次注射后未達到點燃標準的小鼠，不參與后續(xù)實驗，共造模成功85只小鼠。將造模成功的小鼠隨機分為PTZ組、VPA(300 mg·kg-1)組、人參皂苷Rb1低(10 mg·kg-1)、中(20 mg·kg-1)和高(40 mg·kg-1)劑量組，每組17只。

Racine分級表：0級：無反應；1級：耳朵和面部抽動，包括眨眼，動須，節(jié)奏性咀嚼；2級：頸部肌肉抽動，表現(xiàn)為點頭或甩尾；3級：肌陣攣，前肢抽動；4級：身體立起、雙側后肢強直以及全身陣攣性發(fā)作；5級：全身強直陣攣發(fā)作，失去平衡，跌倒。

2.2給藥 各給藥組每日固定時間腹腔注射相應劑量的藥物，正常組和PTZ組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥30 d。給藥過程中，PTZ組和各給藥組繼續(xù)以35 mg·kg-1腹腔注射PTZ，正常組腹腔注射同等劑量的生理鹽水，5 d 1次。

2.3行為學觀察 注射PTZ后立即將小鼠置于透明箱中，連續(xù)觀察30 min，記錄小鼠的發(fā)作潛伏期和發(fā)作級別。發(fā)作潛伏期記錄為PTZ注射完成后到2級發(fā)作的時間，若30 min內未發(fā)作，則潛伏期記為1 800 s；記錄最高發(fā)作級別，行為學指標可能因為小鼠個體差異而導致各組指標數(shù)量不完全一致。

2.4Fluoro-Jade B(FJB)染色檢測海馬神經元損傷 最后1次給藥后，每組隨機選取6只小鼠，以50 mg·kg-1腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉各組小鼠，置于干凈瓷盤中，打開胸腔、暴露心臟。用注射針自心尖插入主動脈，用止血鉗固定針頭。剪開右心耳，經注射針勻速推入4 ℃的生理鹽水至右心耳流出無血色液體，且小鼠肝臟變黃、兩肺及四肢變白。再用40 g·L-1多聚甲醛灌注，直至小鼠內臟顏色變白、頸部和四肢肌肉僵硬。灌注完成后迅速取腦，浸入40 g·L-1多聚甲醛中固定。石蠟切片脫蠟至水，依次將切片放入二甲苯Ⅰ15 min、二甲苯Ⅱ15 min、無水乙醇Ⅰ5 min、無水乙醇Ⅱ5 min、體積分數(shù)為85%的乙醇5 min、體積分數(shù)為75%的乙醇5 min，最后用蒸餾水洗。用現(xiàn)配的體積分數(shù)為50%的冰醋酸作為溶劑，按照1∶400 配制 FJB 工作液，在畫好圈的組織上加入稀釋好的 FJB 綠色熒光探針，4 ℃過夜。DAPI染核8 min，純水沖洗，用吹風機吹干，二甲苯透明1 min，中性樹脂封片，切片置于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。每張切片在海馬CA1區(qū)隨機取5個視野，用Image J軟件計數(shù)FJB陽性神經元數(shù)量。

2.5生化法檢測大腦皮層和海馬中的Glu含量和GS活性 將剩余各組小鼠斷頭取腦，冰上去除嗅球、小腦及低位腦干后，分離大腦皮層和海馬，精密稱定質量后置于液氮中速凍，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存。取時按照體質量1∶9的比例加入提取液，以4 000 r·min-1離心10 min，取上清液，置于冰上待測。分別按照Glu和GS試劑盒說明書測定小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量和GS活性。

2.6RT-PCR法檢測大腦皮層和海馬中GLT-1和GS mRNA表達 取大腦皮層和海馬置于預冷的研缽中，加入液氮研磨成粉末狀。按照SteadyPure通用型RNA提取試劑盒說明書操作提取RNA，按反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行RT-PCR擴增。內參β-actin的引物序列為：F：5′-ACTCCTATGTGGGTGACGAGG-3′，R：5′-CACACGCAGCTCATTGTAGAAG-3′；GLT-1的引物序列為：F：5′-TAGATATGTCGGTTGCCGTTTG-3′，R：5′-AGCCCAGTCCACCAGTGAGG-3′；GS的引物序列為：F：5′-TATTACTGCGGTGTGGGAGC-3′，R：5′-CCCATTCGGATCCCCTCACA-3′。采用PCR方法對GLT-1和GS的mRNA水平進行檢測，實驗結果采用2-△△CT法進行分析。△CT=目的基因CT值-內參基因CT值。

2.7Western Blot法檢測大腦皮層和海馬中GLT-1和GS蛋白表達 預冷 RIPA 裂解液，加入蛋白酶抑制劑。將組織按照1∶10加入RIPA裂解液進行勻漿。冰上孵育 20 min 后，在4 ℃條件下以13 000 r·min-1離心 20 min。取上清液，分裝后于-80 ℃保存，待測。按照 BCA 蛋白定量試劑盒說明書操作，用酶標儀測定各個樣品吸光度值A，根據(jù)標準曲線計算各組蛋白質量濃度。以 RIPA 調整蛋白質量濃度，樣品終質量濃度為 0.5 μg·μL-1，95 ℃，變性 5 min。將樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，上樣量為10 μL，轉移至PVDF膜，用50 g·L-1脫脂奶粉室溫封閉1.5 h。TBST洗膜后加入一抗稀釋液(β-actin的稀釋比例為1∶12 000；GLT-1稀釋比例為1∶1 000；GS的稀釋比例為1∶1 500)，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜，滴加ECL發(fā)光劑顯影，ChemiDocTMMP系統(tǒng)采集圖像，Image J軟件進行分析，計算GLT-1和GS蛋白表達量。

3 結果

3.1人參皂苷Rb1對癲癇小鼠發(fā)作級別和發(fā)作潛伏期的影響 在造模過程中，PTZ組小鼠逐漸出現(xiàn)面部抽動、甩尾和雙側前肢抽動等癥狀，繼而雙側后肢強直或全身抽搐、跌倒，隨造模時間延長癥狀逐漸明顯。在造模第22天，大多數(shù)造模小鼠癲癇發(fā)作達到4級或5級，小鼠發(fā)作潛伏期也顯著降低(P<0.01)，確定造模成功；在此期間，正常組小鼠未見任何發(fā)作，未出現(xiàn)上述癥狀。

造模成功后，小鼠重新分組并開始治療性給藥。結果顯示，隨著給藥時間的延長，多數(shù)小鼠癲癇的發(fā)作級別由4～5級逐漸降低為2～3級。其中，VPA發(fā)揮藥效較快，給藥10 d后癲癇小鼠發(fā)作級別就開始出現(xiàn)明顯變化；給藥30 d后，癲癇小鼠后肢強直和全身抽搐癥狀均得到顯著改善，且發(fā)作潛伏期顯著延長。人參皂苷Rb1各劑量組小鼠在給藥20 d后癲癇發(fā)作級別出現(xiàn)明顯變化；給藥30 d后，癲癇小鼠后肢強直和全身抽搐癥狀也得到顯著改善，大部分小鼠發(fā)作級別降至2～3級，發(fā)作潛伏期顯著延長，且人參皂苷Rb1能較好地改善癲癇小鼠后肢強直的情況。結果表明，人參皂苷Rb1治療性給藥，能顯著改善由PTZ引起的小鼠癲癇癥狀。結果見表1和表2。

表1 人參皂苷Rb1對給藥后不同時間點癲癇小鼠發(fā)作級別的影響

表2 人參皂苷Rb1對給藥后不同時間點癲癇小鼠發(fā)作潛伏期的影響

3.2人參皂苷Rb1減輕癲癇小鼠海馬CA1區(qū)神經細胞損傷 FJB染料可與變性的神經細胞結合發(fā)出綠色熒光，而不與正常神經細胞結合，F(xiàn)JB陽性細胞數(shù)量可用于評估神經細胞變性情況。與正常組相比，PTZ組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量顯著增多(P<0.01)，提示PTZ誘發(fā)的癲癇會造成小鼠海馬CA1區(qū)神經細胞變性損傷；與PTZ組相比，人參皂苷Rb1各給藥組小鼠海馬CA1區(qū)FJB陽性細胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，海馬其他部位和大腦皮層FJB陽性細胞數(shù)量變化不明顯。結果表明，人參皂苷Rb1能夠改善PTZ癲癇小鼠海馬CA1區(qū)神經細胞變性損傷。見表3。

表3 人參皂苷Rb1對癲癇小鼠海馬CA1區(qū)神經元變性情況的影響

3.3人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層和海馬Glu含量和GS活性的影響 與正常組相比，PTZ組小鼠大腦皮層和海馬中Glu含量顯著升高，提示癲癇發(fā)作會造成腦組織Glu含量積累。人參皂苷Rb1低、中、高劑量組小鼠大腦皮層和海馬中的Glu含量均低于PTZ組，提示Rb1可改善癲癇狀態(tài)下Glu含量蓄積。GS活性測定結果顯示，PTZ小鼠大腦皮層和海馬中GS活性降低，給予人參皂苷Rb1后GS活性較PTZ組升高，其中人參皂苷Rb1高劑量組作用最顯著(P<0.05)。GS是促使Glu轉化為Gln的關鍵酶，提示人參皂苷Rb1能促進癲癇小鼠腦組織Glu的轉化。見表4。

表4 人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層和海馬Glu含量和GS活性的影響

3.4人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層和海馬中GLT-1 mRNA和蛋白表達的影響 GLT-1是維持細胞外谷氨酸穩(wěn)態(tài)的重要轉運體，其表達減少或功能障礙都可能造成細胞Glu過度積累。與正常組相比，PTZ組小鼠大腦皮層和海馬中的GLT-1 mRNA和蛋白表達顯著降低(P<0.01)，提示癲癇會造成GLT-1表達下調，進而影響其攝取細胞外谷氨酸的功能；人參皂苷Rb1各給藥組小鼠大腦皮層和海馬GLT-1 mRNA和蛋白表達均升高，提示人參皂苷Rb1可能通過上調GLT-1表達促進細胞外谷氨酸的攝取，使Glu含量降低。結果見表5和圖1。

表5 人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層、海馬中GLT-1 mRNA和蛋白表達的影響

3.5人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層和海馬中GS mRNA和蛋白表達的影響 進入星形膠質細胞的Glu，既可參加Glu循環(huán)，也可在GS催化下轉化為谷氨酰胺。GS的表達減少或功能障礙可能導致星形膠質細胞Glu不能被及時代謝，影響星形膠質細胞Glu-Gln循環(huán)。結果顯示，與正常組相比，PTZ組小鼠大腦皮層和海馬的GS mRNA和蛋白表達均顯著降低(P<0.01)，各給藥組小鼠大腦皮層和海馬GS mRNA和蛋白表達較PTZ組均顯著升高。提示人參皂苷Rb1可能通過上調GS的表達恢復其快速代謝谷氨酸的能力，促進星形膠質細胞對細胞外過量谷氨酸的吸收代謝。見表6和圖1。

表6 人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層和海馬中GS mRNA和蛋白表達的影響

圖1 人參皂苷Rb1對癲癇小鼠大腦皮層和海馬GLT-1和GS 蛋白表達的影響

4 討論

據(jù)統(tǒng)計，全世界約有7 000萬人患有癲癇，預計1/3的癲癇患者應用目前的藥物難以得到有效治療[9]。因此，對癲癇的發(fā)病機制及治療藥物的研究至關重要。本研究采用PTZ化學點燃方法建立癲癇小鼠模型，探討人參皂苷Rb1治療性給藥的抗癲癇作用及其作用機制。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠癲癇癥狀穩(wěn)定后，用人參皂苷Rb1治療性給藥30 d，能延長小鼠癲癇發(fā)作潛伏期，有效緩解小鼠癲癇發(fā)作的嚴重程度，并降低癲癇小鼠大腦皮層與海馬中的Glu含量，提高癲癇小鼠大腦皮層和海馬中GLT-1及GS的RNA和蛋白表達，并增加GS活性。FJB染色結果顯示，人參皂苷Rb1對癲癇小鼠海馬神經細胞損傷也有保護作用。結果提示，人參皂苷Rb1治療性給藥具有確切的抗癲癇及神經保護作用，此作用可能與調節(jié)Glu-Gln循環(huán)、減少谷氨酸蓄積有關。

近年來，關于人參皂苷Rb1抗癲癇作用研究時有報道[6，10-11]，但研究者均采用預防性給藥的方法，即癲癇造模與藥物干預同時開始，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rb1具有抗癲癇作用。從嚴格意義上講，這些發(fā)現(xiàn)重點說明人參皂苷Rb1具有預防癲癇的效果。然而，對于已經患有癲癇的患者或動物，人參皂苷Rb1是否有治療效果尚未知。因此本研究采用亞驚厥劑量PTZ，誘導ICR小鼠慢性癲癇發(fā)作，造模成功后采用藥物干預，突出強調人參皂苷Rb1對癲癇小鼠的治療作用，與臨床上的治療方法保持一致，進一步評價人參皂苷Rb1的抗癲癇作用。給藥30 d后發(fā)現(xiàn)，經過人參皂苷Rb1治療的癲癇小鼠，后肢強直、全身抽搐和跌倒的癥狀得到顯著改善，發(fā)作級別和發(fā)作潛伏期顯著降低，表明人參皂苷Rb1能明顯改善PTZ癲癇小鼠發(fā)作的癥狀。

PTZ是一種γ-氨基丁酸(GABA)受體拮抗劑，通過抑制GABA能神經元的功能誘導動物產生驚厥，其誘導的癲癇模型與臨床上小發(fā)作和失神發(fā)作類似，通過該模型篩選出的抗癲癇藥物在臨床上可用于小發(fā)作和失神發(fā)作的治療[12-14]。人參皂苷Rb1能緩解PTZ誘導的癲癇小鼠的發(fā)作嚴重程度，在后續(xù)的臨床應用方面，人參皂苷Rb1可用于癲癇小發(fā)作和失神發(fā)作的治療，對其他類型發(fā)作也有一定作用，需要進一步研究。與PTZ相比，人參皂苷Rb1藥效發(fā)揮較慢，治療周期長，但其不良反應少，對患者傷害小。另外，作為人參的主要藥效活性成分，人參皂苷Rb1已被證明具有神經保護作用[15]，能夠改善學習記憶能力，長期用藥可預防疾病的發(fā)生，因此，人參皂苷Rb1治療癲癇具有巨大潛力和優(yōu)勢。

Glu是中樞神經系統(tǒng)最主要的興奮性小分子神經遞質，在正常生理狀態(tài)下可保持較低的細胞外水平。過量的Glu積累在突觸間隙會造成神經元過度興奮甚至神經元死亡，因此，必須迅速清除細胞外過量的Glu[16-17]。Glu正常水平的保持得益于星形膠質細胞膜上的攝取系統(tǒng)和細胞內的代謝酶。Glu在神經元的囊泡中和突觸間隙有明顯的濃度差，這種濃度差依賴谷氨酸轉運體來維持[18]。當突觸間隙的Glu濃度出現(xiàn)異常時，谷氨酸轉運體就會迅速做出反應來調節(jié)Glu穩(wěn)態(tài)。GLT-1作為細胞外Glu清除的關鍵轉運體，對于維持中樞神經系統(tǒng)正常的生理功能至關重要。GS是人體中唯一能夠合成谷氨酰胺的已知酶，主要作用是催化Glu和氨生成谷氨酰胺[19]。GS表達和活性的改變會影響Glu的清除和谷氨酰胺的積累與釋放，而谷氨酰胺又是合成Glu和GABA的前體物質[20]，因此，GLT-1和GS通過調節(jié)細胞內外Glu含量和GABA的合成直接影響大腦興奮與抑制的平衡。Glu代謝異常是腦內興奮與抑制失衡的直接原因之一，而腦內興奮與抑制失衡可能會導致癲癇發(fā)作。GLT-1和GS作為Glu代謝調節(jié)的重要元件，其對癲癇的發(fā)病和治療具有重要意義。本實驗結果表明，人參皂苷Rb1能夠上調癲癇小鼠的GLT-1表達和GS活性，從而調節(jié)Glu代謝，而其是否能夠通過調節(jié)GLT-1與GS進而影響抑制性神經遞質GABA的合成還有待進一步研究。此外，就GLT-1而言，其表達和功能變化對細胞內Glu代謝轉化的影響也值得深入探討。

綜上所述，人參皂苷Rb1治療性給藥能緩解癲癇小鼠的發(fā)作嚴重程度，改善腦組織神經元損傷，發(fā)揮抗癲癇作用，其機制可能與上調Glu-Gln循環(huán)上的關鍵環(huán)節(jié)GLT-1和GS的表達及活性、調節(jié)Glu代謝、促進中樞神經系統(tǒng)興奮和抑制恢復平衡有關。