提高益氣養(yǎng)血口服液質(zhì)量標準的研究

李 嬋，楊飛快，薛美玲

(1.陜西省藥品和疫苗檢查中心，西安 710065； 2.金花企業(yè)(集團)股份有限公司西安金花制藥廠，西安 710065)

益氣養(yǎng)血口服液是由人參、黃芪、淫羊藿、麥冬、陳皮及當歸等13味中藥制成的復方制劑，具有益氣養(yǎng)血的功效，臨床主治氣血不足所致的氣短心悸、面色不華、體虛乏力。該產(chǎn)品在全國共有24個批準文號，生產(chǎn)企業(yè)較多，產(chǎn)品質(zhì)量差異較大。益氣養(yǎng)血口服液的質(zhì)量標準現(xiàn)執(zhí)行的是《中國藥典》2020年版[1]，其僅對黃芪甲苷和陳皮進行定性鑒別，對淫羊藿藥材中的淫羊藿苷進行定量控制。本研究在《中國藥典》現(xiàn)行標準的基礎(chǔ)上，參考文獻方法[2-6]，優(yōu)化了黃芪的薄層色譜(TLC)鑒別，增加了麥冬的定性鑒別，在原淫羊藿苷含量測定的基礎(chǔ)上，增加了朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C，采用一測多評法對4種成分的含量進行測定，為益氣養(yǎng)血口服液生產(chǎn)企業(yè)在生產(chǎn)過程中實施有效地監(jiān)督控制提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 U3000型高效液相色譜儀，UV/DAD檢測器，變色龍7工作站，均購自戴安(中國)有限公司；BP211D型電子天平(德國賽多利斯集團)；AS3120型超聲波清洗器(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

1.2試藥 黃芪甲苷對照品(批號110781-201717，供含量測定用)，麥冬對照藥材(批號121013-201711，供鑒別用)，淫羊藿苷對照品(批號110737-201516，供含量測定用)，均購自中國食品藥品檢定研究院；朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ對照品，均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；水為超純水，自制；甲醇、乙腈為色譜純，均購自Sigma公司；D101型大孔吸附樹脂(西安藍曉科技新材料科技有限公司)；其余試劑均為分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司。益氣養(yǎng)血口服液：通藥制藥集團股份有限公司(批號191028)，石家莊北方藥業(yè)集團有限公司(批號191210)，江蘇聚榮集團有限公司(批號19081901)，通化萬通藥業(yè)股份有限公司(批號191103)，四平正和制藥有限公司(批號191028)，金花企業(yè)(集團)股份有限公司西安金花制藥廠(批號20201201)。黃芪、麥冬等藥材購自陜西興盛德藥業(yè)有限公司，經(jīng)西安市食品藥品檢驗所謝志民主任藥師鑒定為正品。

2 TLC鑒別

2.1黃芪 取本品20 mL，用水飽和的正丁醇(過夜)振搖提取3次，每次25 mL，合并3次正丁醇液，分別用20、20、15 mL氨試液洗滌3次，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加入稀乙醇1 mL使之溶解，置于中性氧化鋁柱(100～120目，3 g，內(nèi)徑為1.5 cm)上，加體積分數(shù)為40%的乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水1 mL使溶解，過D101大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為2.1 cm，柱高為12 cm)，分別加水30 mL、體積分數(shù)為40%的乙醇50 mL洗脫，棄去洗脫液，用體積分數(shù)為70%的乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，加甲醇1 mL，使殘渣溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的對照品溶液；取上述供試品溶液、對照品溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，展開劑為三氯甲烷-甲醇-水(13∶7∶2)，10 ℃以下放置過夜，取下層溶液展開，取出，晾干，噴以體積分數(shù)為10%的硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，日光下顯相同的淡紫紅色斑點；紫外光365 nm處顯相同顏色的熒光斑點。

2.2麥冬 取本品20 mL，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次25 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，再加濃鹽酸(質(zhì)量分數(shù)為37%)2.5 mL，置于沸水浴上回流1 h，放冷，用二氯甲烷振搖提取2次，每次20 mL，合并二氯甲烷溶液，蒸干，殘渣加二氯甲烷1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取麥冬對照藥材1 g，加水50 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液濃縮至10 mL，再加濃鹽酸(質(zhì)量分數(shù)為37%)2.5 mL，置于沸水浴上回流1 h，同法制得對照藥材溶液。取上述供試品溶液、對照藥材溶液各5 μL，點于同一硅膠G板上，展開劑為二氯甲烷-丙酮(4∶1)，展開，取出，噴以體積分數(shù)為10%的硫酸乙醇，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視，供試品色譜中，在與麥冬對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的紫黑色斑點。

3 含量測定

3.1淫羊藿苷

3.1.1色譜條件 Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈-0.5 mL· L-1磷酸溶液(26∶74)；檢測波長：270 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

3.1.2對照品溶液的制備

3.1.2.1淫羊藿苷對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷對照品10.19 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.2.2混合對照品溶液的制備 分別精密稱取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷對照品10.44、10.11、10.07、10.58 mg，置于同一100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

3.1.3供試品溶液的制備 取6個不同生產(chǎn)廠家的益氣養(yǎng)血口服液，分別精密量取3 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，取上清液，濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.1.4陰性樣品溶液 按照益氣養(yǎng)血口服液的工藝處方制備不含淫羊藿的陰性樣品，再按照3.1.3項下方法制備陰性樣品溶液。

3.1.5系統(tǒng)適用性考察 分別取3.1.2.1項下制備的淫羊藿苷對照品溶液、3.1.3項下制備的供試品溶液和3.1.4項下制備的陰性樣品溶液，按照3.1.1項下色譜條件測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，在該色譜條件下，淫羊藿苷及相鄰色譜峰均可達到基線分離，各峰之間分離度均大于1.5，淫羊藿苷的理論塔板數(shù)按照淫羊藿苷峰計算應(yīng)不低于2 500，陰性樣品無干擾。

3.1.6淫羊藿苷含量測定結(jié)果 取市售6個不同廠家生產(chǎn)的益氣養(yǎng)血口服液，按照含量測定項下方法進行測定，現(xiàn)行標準要求本品每1 mL含淫羊藿以淫羊藿苷(C33H46O15)計，不得少于0.12 mg；由表1可知，6批樣品中淫羊藿苷的含量測定結(jié)果均符合規(guī)定，結(jié)果見表1。

表1 不同生產(chǎn)企業(yè)益氣養(yǎng)血口服液中淫羊藿苷的含量測定結(jié)果 (n=2)

3.1.7供試品溶液色譜圖分析 在供試品溶液色譜圖中，淫羊藿苷色譜峰峰形較好，與其相鄰色譜峰的分離度高。此外，該色譜圖中有多個峰形好、分離度高的色譜峰，經(jīng)對處方進行分析，并采用對照品進行定位可知，分別為朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷。結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC圖

3.2朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量測定結(jié)果

3.2.1外標法

3.2.1.1混合對照品溶液 取3.1.2.2項下制備的混合對照品溶液。

3.2.1.2樣品測定結(jié)果 取6個不同廠家生產(chǎn)的益氣養(yǎng)血口服液，按照3.1.3項下供試品溶液方法進行制備，以混合對照溶液中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C為對照，按照外標法進行計算，樣品中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量測定結(jié)果見表2。

3.2.2一測多評法

3.2.2.1相對校正因子 一測多評法[7-14]測定益氣養(yǎng)血口服液中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量，相對校正因子的測定方法采用標準曲線法，色譜條件及樣品處理同3.1項下，以淫羊藿苷為內(nèi)參物，測得朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的相對校正因子分別為0.826、0.831、0.874。

3.2.2.2樣品測定結(jié)果 采用相對校正因子計算樣品中朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量，結(jié)果見表2。

3.2.32種方法的結(jié)果對比 采用淫羊藿苷單對照一測多評法及多對照外標法[15-16]測定6個不同廠家生產(chǎn)的益氣養(yǎng)血口服液中淫羊藿類成分的含量，結(jié)果見表2。由表2可知，采用淫羊藿苷單對照一測多評法的測定結(jié)果與外標法多對照測定結(jié)果基本一致；考慮到朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C對照品價格昂貴且不易購買，因此采用淫羊藿苷單對照一測多評法，其檢測效率高，檢驗成本顯著降低。

表2 淫羊藿類成分含量測定結(jié)果 (n=2)

4 討論

目前市場上淫羊藿藥材質(zhì)量差異較大[17-19]，直接影響成品制劑的治療效果?，F(xiàn)行標準中僅測定淫羊藿苷單一成分含量對制劑進行控制，且淫羊藿苷含量限度僅為不低于0.12 mg·mL-1，不能較好地反映成品制劑的質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，供試品溶液色譜圖中，淫羊藿苷前后有多個色譜峰，且峰形較好、分離度高，因此對處方進行分析，并通過對照品定位進行排查，在現(xiàn)有淫羊藿苷含量測定的色譜條件下，對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、陳皮中橙皮苷、淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和寶霍苷Ⅰ進行定位及篩選，供試品色譜中，最終選擇分離度好、峰面積較大的朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C進行研究[20]。

本研究依據(jù)《中國藥典》2020年版中益氣養(yǎng)血口服液質(zhì)量標準，在不改變淫羊藿苷含量測定色譜條件的基礎(chǔ)上，采用一測多評法以價廉的淫羊藿苷為內(nèi)參物，對供試品中多種成分含量進行測定，避免了外標法需要采用多種對照品才能進行檢測的弊端，解決了部分對照品不易采購、企業(yè)檢測成本高等問題，克服了不同色譜系統(tǒng)操作繁瑣、檢測周期長的缺點，可同時實現(xiàn)中藥制劑產(chǎn)品多組分內(nèi)代表性成分的快速檢測，因此可供各生產(chǎn)企業(yè)用于益氣養(yǎng)血口服液中多種成分的檢測與監(jiān)控[4,6，20]。

原檢驗方法中供試品取樣量為10 mL，用5 mL水飽和的正丁醇萃取，用氨試液洗滌后，需要通過中性氧化鋁、D101大孔吸附樹脂，操作過程復雜，程序較多，不易檢出黃芪甲苷。本研究優(yōu)化了黃芪甲苷的TLC法，保證了一次檢出成功率；同時在原鑒別的基礎(chǔ)上增加了麥冬的TLC法鑒別，提高了其質(zhì)量標準。