高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定不同產(chǎn)地三葉青主要化學(xué)成分

孫崇魯，俞松林，楊穎欣，陳宏降，張煜炯

(浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江 寧波 315100)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)為葡萄科崖爬藤屬植物，學(xué)名三葉崖爬藤，又名角烏蘞莓、石老鼠、金錢吊葫蘆等，是中國特有珍稀植物，主要分布于我國安徽、云南、福建、浙江、江西、湖南等地，2018年入選新“浙八味”中藥材培育品種，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等作用，民間常用于小兒高熱驚厥、咽痛、肝炎、痛瘡、毒蛇咬傷、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及病毒性腦膜炎等多種疾病的治療[1]?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)三葉青塊根提取物具有抗腫瘤[2]、抗病毒[3]、抗炎[4]、保肝護(hù)肝[5]、免疫調(diào)節(jié)[6]等作用。同時(shí)三葉青也是多種中成藥(如華佗風(fēng)痛寶、結(jié)石康膠囊、金絲地甲膠囊、金芪片等)以及保健品的主要原料。近年來三葉青野生資源因過度開發(fā)而瀕臨滅絕，被列入“浙江省首批種質(zhì)資源保護(hù)名錄”[7]。

目前藥材市場(chǎng)上三葉青主要來源于人工栽培，主產(chǎn)于浙江、福建、云南、貴州等地，受氣候、土壤等條件的影響，不同產(chǎn)地三葉青藥材形態(tài)、質(zhì)量差異較大。質(zhì)量優(yōu)劣評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的缺乏已經(jīng)嚴(yán)重制約了三葉青藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)是一種新型的藥物成分分析方法，根據(jù)化合物分子量的不同，采用多重離子對(duì)監(jiān)測(cè)(MRM)技術(shù)進(jìn)行快速分析，具有抗干擾強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)[8]。近年來該技術(shù)在分析化學(xué)領(lǐng)域尤其在中藥研究領(lǐng)域得到日益廣泛的應(yīng)用。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地三葉青的10種主要成分進(jìn)行同時(shí)定量研究，為三葉青的質(zhì)量控制提供了科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與試劑

QTRAP 4500 串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)(AB Sciex公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-800KDB型高功率數(shù)控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Secura225D-1CN電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Sorvall ST16R型高速冷凍離心機(jī)(德國Thermo公司)；DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱(寧波江南儀器廠)；甲醇、乙腈(德國Merck公司)，色譜純；甲酸(美國Fisher公司)，色譜純。

山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號(hào)Y15N8H48277)、紫英云苷(批號(hào)Y15S9H70466)、原花青素B1(批號(hào)P11N8L48152)、蘆丁(批號(hào)Y16M9S61523)、表兒茶素(批號(hào)K19J9R66088)、山柰酚(批號(hào)C26J8Y38642)、白藜蘆醇(批號(hào)R13M8S 36114)、虎杖苷(批號(hào)T31O7F23950)等對(duì)照品購自上海源葉生物科技有限公司。槲皮苷、異槲皮苷由本實(shí)驗(yàn)室從三葉青中分離制備，1H、13C NMR和MS 數(shù)據(jù)經(jīng)文獻(xiàn)[9-12]進(jìn)行比較確認(rèn)；純度經(jīng) HPLC-DAD (面積歸一法)檢測(cè)含量均大于98.0%。

三葉青采自浙江省、貴州省、云南省等13個(gè)不同產(chǎn)地，每個(gè)采樣點(diǎn)采集2份樣品，見表1。原植物經(jīng)浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校彭昕教授鑒定為三葉青。所得藥材均置于烘箱中，40 ℃烘干72 h，隨后粉碎成細(xì)粉備用。

表1 不同產(chǎn)地三葉青地上部分樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

精密稱定樣品粉末0.300 0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密稱定，于超聲波細(xì)胞破碎儀中超聲處理(功率：600 W)60min，取出，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，將萃取液離心15 min，取上清液用0.22 μm 疏水PTFE濾頭進(jìn)行過濾，即得供試品溶液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

取各對(duì)照品約10.0 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，得各對(duì)照品貯備液。分別精密量取各對(duì)照品貯備液0.5 mL于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，制備成質(zhì)量濃度各為50 μg/mL的混合對(duì)照品溶液，以0.22 μm 微孔濾膜濾過，于冰箱中保存，備用。

2.3 色譜-質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱為飛諾美Kinete XB-C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流動(dòng)相為乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～1 min，10%A；1～5 min，10%～40%A；5～10 min，40%～60%A；10～11 min，60%～80%A；11～12 min，10%A；體積流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離離子源(ESI)，噴霧電壓為4.5 kV；霧化溫度為450 ℃；氣簾氣為35psi；輔助氣為40 psi；質(zhì)譜掃描采用MRM掃描模式；去簇電壓(Declustering Potential，DP)參數(shù)和碰撞電壓(Collision Energy，CE)質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化通過蠕動(dòng)針泵注射的方法調(diào)諧各標(biāo)準(zhǔn)化合物。所得參數(shù)，見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)信息

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密量取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(50 μg/mL)適量，用甲醇稀釋，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，依次為20.0、50.0、100.0、500、1 000 μg/L，以0.22 μm微孔濾膜濾過，在“2.3”項(xiàng)色譜質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，以對(duì)照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果見表3。其中混合對(duì)照品溶液(100 μg/L)的總離子流，見圖1。

表 3 回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

注：1-原花青素B1；2-表兒茶素；3-蘆丁；4-異槲皮苷；5-虎杖苷；6-山柰酚-3-O-蕓香糖苷；7-紫英云苷；8-槲皮苷；9-白藜蘆醇；10-山柰酚。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 檢出限和定量限的測(cè)定 根據(jù) 10種對(duì)照品S/N=3時(shí)的溶液濃度，計(jì)算出檢出濃度；根據(jù)S/N=10時(shí)的對(duì)照品溶液濃度，計(jì)算出定量濃度。見表3。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別量取不同濃度的混合對(duì)照品溶液(20、100.0、1 000 μg/L)連續(xù)測(cè)定6次，測(cè)得各目標(biāo)化合物峰面積的RSD范圍為1.47%～3.67%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批三葉青樣品粉末6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算10種化合物的含量，其RSD范圍為 1.96%～4.83%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在配制后 0、2、4、6、12、24 h依法測(cè)定。根據(jù)各化合物的峰面積計(jì)算RSD值范圍為1.18%～3.77%，說明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一批次已知含量的三葉青樣品6份，約0.3 g，精密加入三個(gè)不同濃度的 10 種對(duì)照品溶液(20、100.0、1 000 μg/L)，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定含量，計(jì)算各個(gè)化合物回收率范圍在97.68%～104.26%，其RSD范圍為1.66%～3.83%，表明所用方法回收率良好。

2.6 樣品含量測(cè)定

精密稱量不同產(chǎn)地的三葉青粉末，按“2.1”項(xiàng)制備供試品溶液，依“2.3”項(xiàng)的 UPLC-MS/MS 條件測(cè)定，不同產(chǎn)地的三葉青各化合物的含量，見表3。

3 討論

本研究采集了13個(gè)三葉青產(chǎn)區(qū)的藥材樣品，采用UPLC-MS/MS 技術(shù)同時(shí)測(cè)定了山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫英云苷、槲皮苷、異槲皮苷、原花青素B1、蘆丁、表兒茶素、山柰酚、白藜蘆醇、虎杖苷10個(gè)指標(biāo)化學(xué)成分的含量。結(jié)果表明，本研究所用方法操作簡便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性好，可用于三葉青藥材中10種成分含量的同時(shí)測(cè)定，研究可為評(píng)價(jià)三葉青藥材的質(zhì)量提供一種切實(shí)可行的參考根據(jù)。

本研究測(cè)定了13批三葉青的含量，結(jié)果表明不同產(chǎn)地三葉青中10種主要成分含量差異很大，同一省份不同城市的藥材也有較大差異，甚至有些批次中未檢測(cè)出某些化合物，這可能與不同種植基地的三葉青引種來源不同以及生態(tài)環(huán)境的差異性有關(guān)。從收集的13批次的平均值來看，三葉青塊根中有效成分含量從高到低依次為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁 、異槲皮苷 、紫云英苷，原花青素 B1、虎杖苷、槲皮苷、山柰酚、白藜蘆醇、表兒茶素。