基于線粒體COI和COII基因的米象與玉米象的分子鑒定

張 蒙 趙艷艷 魯玉杰 高 晴

(河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南糧食作物協同創(chuàng)新中心， 糧食儲藏安全河南省協同創(chuàng)新中心，鄭州 450001)

米象Sitophilusoryzea(Linnaeus)、玉米象SitophiluszeamaisMotschulsky均屬鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)，為中國糧油儲藏技術規(guī)范中規(guī)定的主要害蟲[1]。廣泛分布于全世界多個國家和地區(qū)，在我國亦是分布廣泛且危害嚴重的儲藏物蛀食性害蟲[2]。

米象可以在田間感染糧食，在經收獲入倉的糧食中通常已隱藏卵、幼蟲或蛹期的害蟲，這些隱蔽蟲態(tài)在糧粒內取食發(fā)育，影響糧食品質，造成儲糧損失及相當嚴重的危害[3]。米象和玉米象同屬象甲科，為近緣種，二者幼蟲和成蟲在外部形態(tài)上極其相似，而且此兩種象蟲的食性、為害方式、越冬場所、上爬假死等生活習性及影響它們生長發(fā)育和繁殖的溫度、濕度、天敵等生態(tài)因子也很相似，僅靠觀察兩者外部形態(tài)進行區(qū)分十分困難[4]。但這兩種害蟲對殺蟲藥劑的抗藥性有很大的差別，在儲藏物防治上也存在不同的難度，根據已發(fā)表的研究調查和報道，米象已出現較高磷化氫抗性的品系，而玉米象尚未見到有明顯磷化氫抗性的品系[5]，故快速的鑒定米象和玉米象對采取相應的防治措施十分重要。

為了快速準確的鑒別近緣物種，Tautz等[6]在DNA分類學(DNA Taxonomy)的基礎上提出DNA條形碼技術，即利用一段標準基因的序列做標記，通過PCR技術和基因序列分析的分子鑒定技術來鑒別檢測不同物種和相同物種間不同個體差異的目的。標準基因序列的選擇既應該足夠保守，利用通用引物能夠大量擴增，又應該有足夠的變異來區(qū)分不同物種DNA序列[7]。線粒體DNA(mtDNA)中的細胞色素氧化酶I(COI)基因和細胞色素氧化酶II(COII)基因序列被廣泛用做標準序列對物種進行快速準確的鑒定和分類。陳春生等[8]利用線粒體COI基因基于PCR技術擴增mtCOI基因序列并測序，然后構建分子進化樹建立了對鼠類不同物種進行快速鑒定和分類的方法。彭居俐等[9]研究了基于線粒體COI基因的4種鲌屬魚類進行物種鑒定。王康等[10]基于線粒體COI和COII基因序列差異建立了沙果小食心蟲和梨小食心蟲的分子鑒定方法，解決了快速準確鑒別這2種食心蟲的難題。倪艷等[11]通過對6種斑粉蝶的COI和COII基因的部分序列進行分析并對聚類關系進行分析，結果和形態(tài)學結果一致并探討了斑粉蝶屬Delias的系統(tǒng)發(fā)生關系。眾多研究都表明利用線粒體COI和COII此兩個基因序列的差異可對近緣種進行分子鑒定。

本研究從不同地區(qū)的糧食儲備庫采集米象和玉米象試蟲，提取試蟲的基因組DNA，利用PCR擴增試蟲的線粒體COI和COII基因序列，將所獲得的基因序列在GenBank中進行BLAST比對和基因序列相似性分析，然后分別計算基于COI和COII基因序列的玉米象、米象種內及種間遺傳距離，并分別構建COI和COII基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹，以此建立近緣種米象和玉米象的分子鑒定方法，為這2種儲糧害蟲的快速準確鑒定及預測預報提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

本研究所用的米象和玉米象樣本采自于河南鄭州、廣西南寧、山東煙臺、江蘇通州、四川成都、廣東中山、湖南長沙、北京中糧的某糧庫或加工廠。試蟲樣本均以水分16%的小麥為飼料，在溫度為28～32 ℃、相對濕度為65%～75% RH的恒溫培養(yǎng)箱中，于黑暗條件下培養(yǎng)，用于形態(tài)學鑒定和DNA提取。用于研究的試蟲樣本的信息如表1所示。

表1 米象和玉米象試蟲信息

1.2 基因組DNA提取

在采集的樣本中，隨機挑選米象和玉米象樣本，每個地理種群選取5頭試蟲用于單頭試蟲DNA的提取。利用AxyPrep基因組DNA小量試劑盒提取試蟲的基因組DNA，提取方法參考試劑盒說明書中的步驟進行。提取的基因組DNA置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增及序列測定

根據已發(fā)表研究，選用和設計擴增米象和玉米象COI和COII基因的引物。擴增米象和玉米象線粒體COI基因的通用引物LCO1490/HCO2198[12-14]，分別為：

LCO1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG，

HCO2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAATCA；

根據NCBI數據庫中的米象和玉米象線粒體COII基因序列，參考已有報道[15]，并稍作修改，設計擴增COII基因片段的上下游特異性引物分別為： COIIF-5'-TCTAATAGAACACCTTACCTTA-3'，COIIR-5'-CCACAGATTTCAGAGCATTG-3'。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

PCR擴增反應總體系為25 μL，其中DNA模板4 μL，上游和下游引物各2 μL(10 μM)， 12.5 μL Premix Taq(TaKaRa TaqTM)，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性45 s，退火延伸45 s(COI基因Tm：56 ℃，COII基因Tm：58 ℃)，72 ℃延伸45 s，進行35個循環(huán)；循環(huán)結束后再72 ℃延伸6 min。所有PCR擴增獲得的片段，在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳檢測為目的條帶的PCR產物進行切膠回收，膠回收采用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒進行，具體方法參考試劑盒說明書。最后將純化產物送往生工生物工程(上海)有限公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

將測序所得的序列在GenBank中進行BLAST比對搜索，并使用DNAman6.0進行序列拼接，將拼接好的序列使用MEGAV7內含的ClustalW進行序列比對；利用DNAsp軟件打開比對對齊后的序列，分別獲得COI及COII基因序列的單倍型數目。利用MEGAV 7.0分別計算米象和玉米象的COI及COII基因序列的堿基組成(A、T、C、G平均百分含量)，以及各自所含有的C (保守位點)、V (變異位點)、Pi (簡約信息位點)和S (自裔位點)以及所占的百分含量(%)，基于Kimura-2-parameter (K2P) 雙參數模型計算米象和玉米象兩種象蟲的種內及種間遺傳距離，并使用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，對各分支置信度(bootstrap)進行1 000次的重復檢驗。

2 結果與分析

2.1 米象和玉米象線粒體COI和COII基因序列分析

本實驗成功擴增得到所有米象和玉米象試蟲的線粒體COI和COII基因序列，其中COI基因序列長度為712 bp，COII基因序列長度為546 bp。將所得序列在GenBank中進行BLAST比對和相似度分析，結果表明，本實驗獲得的米象COI基因和COII基因序列與GenBank中登錄的米象COI基因(登錄號：GU196317.1)和COII基因(登錄號：KX190700.1)對應序列的相似性分別為98.87%～99.70%和99.72%～100%；測得玉米象COI基因和COII基因序列與GenBank中登錄的米象COI基因(登錄號：KU757289.1)和COII基因(登錄號：KX373614.1)對應序列的相似性分別為98.73%～99.55%和99.46%～100%。

注：白色代表種間變異位點,下同。圖1 米象和玉米象COI基因序列比對

米象和玉米象COI和COII基因序列的比對結果分別見圖1和圖2。試蟲樣本共獲得9個米象的COI基因單倍型(GenBank登錄號：MT863612、MT863611、MT863610、MT872410、MT872409、MT872406、MT872408、MT872411、MT872405)，這9個單倍型在10個堿基位點上具有多態(tài)性，9個單倍型之間的相似度在98.6% 以上。試蟲樣本共獲得1個玉米象的COI基因單倍型(GenBank登錄號：MT863609)。米象和玉米象COI基因種間的相似度在85.84%～86.92%，COI基因在2種象蟲之間存在42個變異位點(圖1)。

試蟲樣本共獲得3個米象COII基因單倍型(GenBank登錄號：MW119321、MW119322、MW119323)，這3個單倍型在 2個堿基位點上具有多態(tài)性，9個單倍型之間的相似度在99.6% 以上。試蟲樣本共獲得8個玉米象COII基因單倍型(GenBank登錄號：MW119313、MW119314、MW119315、MW119316、MW119317、MW119318、MW119319、MW119320)，這8個單倍型在 10個堿基位點上具有多態(tài)性，8個單倍型之間的相似度在98.2% 以上。米象和玉米象COII基因種間的相似度在84.47%～87.66%。米象和玉米象COII基因種間的相似度在86.42%～88.14%，COII基因在2種象蟲之間存在21個變異位點(圖2)。

圖2 米象和玉米象COII基因序列比對

利用MEGAV7軟件進行序列比對，分析COI和COII基因序列堿基組成。COI基因序列的712個堿基位點中，C保守位點521個，比例約為78.46%，COII基因序列的549個堿基位點中，保守位點457個，比例約為84.47%；COI基因序列V變異位點142個，比例約為21.38%，COII基因序列V變異位點84個，比例約為15.52%；COI基因序列Pi簡約信息位點91個，比例約為13.70%，COII基因序列Pi簡約信息位點29個，比例約為5.36%；COI基因序列S自裔位點51個，比例約為7.68%，COII基因序列S自裔位點55個，比例約為10.16%；COI基因序列T、C、A、G四種堿基的平均含量為34.30%、19.70%、30.70%、15.30%，A+T的平均含量為65.0%，C+G的平均含量為35.0%。COII基因序列T、C、A、G四種堿基的平均含量為34.50%、9.90%、36.00%、19.60%，A+T的平均含量為70.00%，C+G的平均含量為29.50%，核苷酸堿基構成均出現了明顯的A+T含量偏倚現象，此現象皆符合昆蟲線粒體堿基組成的特點[21]。

2.2 遺傳距離

本研究使用MEGAV7軟件基于K2P模型計算出米象和玉米象的COI基因和COII基因序列間的遺傳距離。由表2可以看出，米象COI基因序列間的遺傳距離在0.002～0.020，相似度為98.0%～99.8%，2種象蟲COI基因種間遺傳距離為0.145～0.162，相似度為93.8%～95.5%，種間遺傳距離顯著高于種內遺傳距離(df=43，t=73.534，P<0.001)。

由表3可以看出，玉米象COII基因序列間的遺傳距離在0.001～0.023，相似度為97.77%～99.92%，米象COII基因序列間的遺傳距離在0.011～0.015，相似度為98.37%～98.73%，2種象蟲COII基因種間遺傳距離為0.128～0.154，相似度為86.27%～88.31%，種間遺傳距離顯著高于種內遺傳距離(df=53，t=3.925，P<0.001)。

表2 米象和玉米象COI基因單倍型間遺傳距離和相似度

表3 米象和玉米象COII基因單倍型間遺傳距離和相似度

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹

以綠豆象CallosobruchuschinensisLinnaeus COI基因序列(GenBank登錄號：AY625416.1)作外群，將本實驗獲得的9個米象COI基因單倍型序列和2個已登錄的米象COI基因序列(GenBank登錄號：AY131099、GU196318)，以及1個玉米象COI基因單倍型序列和2個已登錄的玉米象COI基因序列(GenBank登錄號：AY131100、MG968936)構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果分析顯示(圖3)，米象和玉米象的COI基因單倍型明顯分開，所有的米象COI基因單倍型各自聚在一支。

以綠豆象C.chinensisLinnaeus COII基因序列(GenBank登錄號：DQ459027.1)作外群，將本實驗獲得的3個米象和8個玉米象COII基因單倍型序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果分析顯示(圖4)，所有米象COII基因單倍型聚為一支，所有玉米象COII基因單倍型另外聚為一支。

圖4 基于米象和玉米象COII基因單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹

SZ1和SO1～SO9為本研究獲得的玉米象和米象COI基因單倍型；AY131100和MG968936為GenBank已登錄的相應玉米象COI基因序列；AY131099和GU196318為GenBank已登錄的相應米象COI基因序列；AY625416.1為GenBank已登錄的相應綠豆象COI基因序列SZ1～SZ8和SO1～SO3為本研究獲得的玉米象和米象COII基因單倍型；DQ459027.1為GenBank已登錄的相應綠豆象COII基因序列。

3 討論

基于線粒體COI和COII基因擴增不同地理種群的米象和玉米象試蟲，獲得多條基因序列，分析得到9個米象和1個玉米象的COI單倍型序列，以及3個米象和8個玉米象COII單倍型序列，結果表明，基于線粒體COI和COII基因的米象和玉米象的種內遺傳距離均小于0.023，而種間遺傳距離均大于0.128，種內距離和種間距離間不存在重疊區(qū)域[16]，并且種內遺傳距離與種間遺傳距離差異顯著(P< 0.001)。因此，本研究所采用的線粒體COI和COII基因序列可以準確應用于米象和玉米象的近緣種鑒定。

基于PCR技術的分子鑒定技術，尤其線粒體COI和COII基因序列目前已廣泛地應用到昆蟲近緣種的鑒定中[17-20]。在利用線粒體基因進行分子鑒定時，不同物種間相同的線粒體基因核苷酸序列差異是最重要的標準[21]。Hebert等利用COI基因序列比較分析多種鱗翅目昆蟲后發(fā)現，COI基因核苷酸序列3%的差異可以作為鑒定不同物種的標準，即不同物種COI基因差異大于3%，同一物種COI基因序列差異小于3%，目前大量的相關研究證實了這一標準的準確[22]。

近年來，隨著分子生物學的迅速發(fā)展，以及PCR技術的日益成熟，分子生物學技術越來越多的用于物種分類和鑒定中，其優(yōu)點是在精細的分子水平能夠快速、精確的對物種進行分類，尤其是近緣種的快速區(qū)分，但由于這些分子技術研究的分子標記片段單一，因此適用范圍因數據庫中參照序列而受限[23]。傳統(tǒng)形態(tài)學進行鑒定和分類的方法，則需要在識別和描述形態(tài)外觀和解剖特征上花費很多時間和精力，且此方法極容易受解剖操作及其他因素影響，在鑒定和分類上存在一定的局限[20]。目前，隨著研究方法和技術的不斷改進和更新，利用線粒體細胞色素C氧化酶亞基I(COI)序列作為標記越來越多的運用于不同物種的分子鑒定中，旨在形成一種快速、準確、經濟實惠及普遍適用的鑒定和分類方法，以滿足不同研究領域和行業(yè)對于不同物種鑒定和分類的迫切需求。

4 結論

本研究結果表明，在6個地理種群的米象和2個地理種群的玉米象樣本中，米象、玉米象的COI和COII基因種內相似度在97.77% 以上，種間相似度在85.84%～88.31% 之間，且2個基因的種間遺傳距離顯著高于種內遺傳距離，米象、玉米象的COI和COII基因單倍型分別在系統(tǒng)發(fā)育樹上明顯各自聚為一支，同種象蟲的基因序列位于相同的進化枝。因此，本研究所采用的線粒體COI和COII基因可以用于近緣種米象和玉米象的分子鑒定。