通過(guò)超高效液相色譜—四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)人尿中42種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)進(jìn)行興奮劑檢測(cè)

劉赟璽 董天宇 張玉峰 常巍 王占良

國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

在20世紀(jì)，人們最初提出的理論認(rèn)為，蛋白質(zhì)必須在胃腸道完全消化成游離氨基酸后，才能被機(jī)體吸收，后轉(zhuǎn)運(yùn)至各個(gè)組織參與代謝[1]。然而，在20世紀(jì)80年代后，大量的研究表明，介于蛋白質(zhì)與氨基酸之間的肽類(lèi)物質(zhì)，也是蛋白質(zhì)代謝吸收的一種方式[2]。而隨著對(duì)肽類(lèi)物質(zhì)的深入研究，人們意識(shí)到肽類(lèi)物質(zhì)除了具備良好的穩(wěn)定性、耐受性、被機(jī)體吸收利用率高等共同特性以外，特定的肽類(lèi)物質(zhì)還具有神經(jīng)遞質(zhì)、免疫活性、抗氧化活性等作用[3，4]。而對(duì)于運(yùn)動(dòng)員來(lái)說(shuō)，部分肽類(lèi)物質(zhì)可以刺激機(jī)體分泌生長(zhǎng)激素，從而影響機(jī)體的新陳代謝，促進(jìn)骨、軟骨、肌肉等的細(xì)胞分裂，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，促進(jìn)脂肪分解提供能量，抑制對(duì)葡萄糖的利用，減少對(duì)葡萄糖的消耗[5]。又因?yàn)殡念?lèi)物質(zhì)易于購(gòu)買(mǎi)獲得，所以成為營(yíng)養(yǎng)學(xué)，藥學(xué)以及興奮劑濫用的又一熱點(diǎn)。

由此，1989年國(guó)際奧林匹克委員會(huì)引入新的興奮劑類(lèi)別“肽類(lèi)激素及其類(lèi)似物”[6]。在2021年的世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，WADA）的禁用清單[7]中，肽類(lèi)物質(zhì)被歸類(lèi)于S2肽類(lèi)激素、生長(zhǎng)因子、相關(guān)物質(zhì)和模擬物，還有部分屬于S5 利尿劑。而小肽類(lèi)物質(zhì)一般是指分子量小于2 kDa 的肽類(lèi)物質(zhì)，通常含有2個(gè)以上的以肽鍵相連接的氨基酸片段[8]，因其在高溫下結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，氣相色譜并不適用于小肽的檢測(cè)。所以近些年來(lái)，采用固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）純化并通過(guò)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography- tandem mass spectrometry，LCMS/MS）測(cè)定生物液體（如尿液）中含有的小肽，已成為藥物檢測(cè)領(lǐng)域中常用的方法。然而，該方法樣品預(yù)處理用時(shí)較長(zhǎng)，步驟復(fù)雜，所需有機(jī)溶劑也較多，還需要使用SPE 柱以及固相萃取裝置，并需要花費(fèi)大量人力物力。分析儀器的改良，為檢測(cè)樣品提供了更高的靈敏度，從而使得一些簡(jiǎn)單快速的樣品預(yù)處理方法得到更好的應(yīng)用，如直接進(jìn)樣方法[9]。

目前，本實(shí)驗(yàn)室采用的分析儀器為超高效液相色譜-Q Exactive Plus 組合型四極桿 Orbitrap 質(zhì)譜儀（ultra-high performance liquid chromatography-Q exactive plus hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer，Q Exactive Plus UHPLC/HRMS），其具備高靈敏度、高精確度以及高分辨率，可提高結(jié)果的可靠性。本研究的目的是基于使用Q Exactive Plus UHPLC/HRMS 聯(lián)用儀，開(kāi)發(fā)和評(píng)估一種簡(jiǎn)單、快速、高效的樣品預(yù)處理及分析方法，并且保留樣品檢測(cè)的靈敏度和特異性，滿(mǎn)足WADA 技術(shù)文件中所規(guī)定的最低要求檢測(cè)濃度（minimum required performance levels，MRPL：）2 ng/mL，用于同時(shí)檢測(cè)人體尿液中不同類(lèi)別的小肽類(lèi)禁用物質(zhì)或代謝物（共42 種），以便涵蓋WADA 禁用清單中生長(zhǎng)激素促分泌劑類(lèi)（growth hormone secretagogues，GHS） 、生長(zhǎng)激素釋放肽類(lèi)（growth hormone-release peptides，GHRP）、促性腺激素釋放因子（Gonadotrophin-releasing factors，GnRHs）、人類(lèi)生長(zhǎng)激素（Human Growth Hormone，hGH）、生長(zhǎng)因子以及生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)劑等分類(lèi)的小肽類(lèi)禁用物質(zhì)、片段及代謝物，還包括兩種利尿劑去氨加壓素（Desmopressin）和苯賴(lài)加壓素（Felypressin）及其代謝物（表1）。

表1 42種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)及其氨基酸序列[8，10，11]

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品GHRP-1、GHRP-4、GHRP-5 來(lái)源于美國(guó)Abbiotec.LLC.；標(biāo)準(zhǔn)品Alexamorelin（3-6）-OH、AOD-9604-metabolite（7-16）、ARA-290、Desmopressin（1-7）-OH，Desmopressin（aa1-7）、Fertirelin、GHRP-1（2-4）FA、GHRP-1-（3-6）-OH、GHRP-1-（3-7）-NH2、GHRP-2（1-3）、GHRP-6 FA、GHRP-6（2-5）FA、GHRP-6（2-6）、Hexarelin（1-3）、Hexarelin（2-5）、Hexarelin（2-6）-OH、Hexarelin（4-6）、Ipamorelin Free Acid、Leuprolide（5-9）、LHRH（1-3）-OH、LHRH（2-10）、Peforelin、Anamorelin、TB-500（1-2）-OH、Ipamorelin 均來(lái)源于澳大利亞Auspep；標(biāo)準(zhǔn)品Alexamorelin、Desmopressin、Leuprolide 來(lái)源于德國(guó)Merck（Sigma-Aldrich）；標(biāo)準(zhǔn)品Buserelin、Deslorelin、Hexarelin Free Acid、LHRH、Nafarelin、Triptorelin 來(lái)源于美國(guó)US Biological Life Sci.公司；其余標(biāo)準(zhǔn)品以及其來(lái)源：Ibutamoren（Key Organics，美國(guó)），Tabimorelin（吉爾生化上海有限公司），F(xiàn)elypressin（MedChemExpress，美國(guó)），GHRP-6（ProSpec-TanyTechnoGene Ltd.，以色列），GHRP-3（Toronto Research Chemicals，Inc.，加拿大）；內(nèi)標(biāo)（Deamino-cys1，val4，D-arg8）-Vasopressin（DCVDV）來(lái)源于吉爾生化上海有限公司。

一次性耗材：2 mL 低吸附離心管（美國(guó)Axygen 公司）和250 μL低吸附內(nèi)插管（美國(guó)Agilent公司）。

所需試劑：乙腈，甲醇，甲酸，甲酸銨（色譜純，美國(guó)DIKMA TECHNOLOGY Inc.公司），去離子高純水。

流動(dòng)相A 的配置：稱(chēng)取2.52 g HPLC 級(jí)別甲酸銨，放入4 L溶劑瓶中，加入4 L去離子高純水，加入2 mL甲酸溶液，充分混勻后，測(cè)量其pH值約為3.5，用裝載了0.45 μm Sartorius Stedim過(guò)濾膜的溶劑過(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾后方可使用。

樣品稀釋溶液的配置：取90 mL上述流動(dòng)相A，過(guò)濾后加入至試劑瓶中，再加入10 mL 甲醇，充分混勻，使得流動(dòng)相A與甲醇最終體積比約為9∶1。

1.2 內(nèi)標(biāo)溶液及標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備

取等體積的乙腈和水混合后加入1%甲酸配置成為標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液。然后，取一定量的小肽固體標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，加入對(duì)應(yīng)量的1% 甲酸乙腈/水（1∶1）溶液，將其配制成為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，渦旋后，再用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋溶液將其逐級(jí)稀釋成為不同濃度的儲(chǔ)備液，最后得到1 ng/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液或0.5 ng/μL的內(nèi)標(biāo)溶液。

1.3 質(zhì)量控制樣品的制備（QCN，QCP 的制備）

收集不同匿名化的空白尿樣混勻后，取3 份各1.5 mL按照小肽檢測(cè)方法前處理后進(jìn)行分析，確定不含待檢測(cè)物質(zhì)，則該尿液樣本可作為陰性質(zhì)量控制樣品（quality control negative，QCN）。取檢測(cè)過(guò)的空白樣品，并加入適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，即可獲得陽(yáng)性質(zhì)量控制樣品（quality control positive，QCP）。

1.4 儀器設(shè)備

Ultimate 3000 超高效液相色譜-Q Exactive Plus組合型四極桿Orbitrap 質(zhì)譜聯(lián)用儀（Q Exactive Plus UHPLC/HRMS）（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）、METTLER PM200 分析天平、Genie Vortex-2 渦旋混合器（美國(guó)ScientificIndustries 公司）、高速離心機(jī)（美國(guó)SCILOGEX 公司）。

1.4.1 色譜條件

液相色譜儀為Ultimate 3000 UHPLC，液相色譜柱為Hypersil GOLD 1.9 μm × 100 mm × 2.1 mm id。使用流動(dòng)相A為10 mmol/L 甲酸銨溶液和流動(dòng)相B為甲醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，洗脫程序如表2所示，流動(dòng)相流速為0.25 ml/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣體積為10 μL，采集時(shí)間為14 min。

表2 色譜梯度洗脫程序

1.4.2 質(zhì)譜條件

采用Q Exactive Plus 組合型四極桿Orbitrap 質(zhì)譜儀，電噴霧離子源（ HESI），以正離子模式掃描；輔助氣溫度（aux gas heater temp）為350℃，流速（aux gas flow rate）為10 arb；鞘氣流速（sheath gas flow rate）：40 arb；噴霧電壓（spray voltage）：3.5 KeV；離子傳輸管溫度（capillary temp）：350℃；采集方式為全掃描（full scan）（resolution:70，000 FWHM;AGC:1e6;max.IT:100 ms;scan range:m/z 80 to 1000）和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（parallel reaction monitoring，PRM）（resolution:35，000 FWHM;AGC:5e4;max.IT:100 ms;isolation window:2.0 m/z;nce:40）兩種方式。

1.5 樣品前處理

取1.5 mL 待測(cè)樣品至低吸附離心管中，放置至室溫后，與QCN和QCP一起加入20 μL內(nèi)標(biāo)溶液（0.5 ng/μL DCVDV），渦旋混勻后，以10000 r/min 離心10 分鐘。將離心后的樣品取150 μL 上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，加入150 μL 樣品稀釋溶液，渦旋混勻后，用Q Exactive Plus UHPLC/HRMS進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

按上述實(shí)驗(yàn)方法，采用Q-Exactive plus UHPLC/HRMS 液質(zhì)聯(lián)用儀的全掃描（full scan）和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)（PRM）模式對(duì)含有42 種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的陽(yáng)性質(zhì)量控制樣品（QCP）進(jìn)行定性分析，得到圖1所示譜圖。如圖1 所示，在1/2 MRPL 下，本方法均可以正確檢出尿樣中的小肽類(lèi)目標(biāo)化合物（其信噪比S/N＞3），色譜峰峰型良好，譜圖清晰，其峰高及半峰寬均可滿(mǎn)足WADA 的相關(guān)技術(shù)文件[12]的要求。而陰性質(zhì)控樣品（QCN）的譜圖在與圖1 對(duì)比后，在相同保留時(shí)間，目標(biāo)化合物選擇相同離子碎片，QCN 的窗口中均未出現(xiàn)干擾峰，因此，該方法具備較高的特異性和可靠性。

2.2 方法驗(yàn)證

該方法驗(yàn)證程序是基于WADA實(shí)驗(yàn)室國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)以及相關(guān)技術(shù)文件等。主要針對(duì)定性檢測(cè)42 種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)或其代謝產(chǎn)物（分子量均小于2kDa），表3 所示為采集過(guò)程中所使用的42 種小肽物質(zhì)的主要質(zhì)譜參數(shù)：Full scan 母離子和3 個(gè)PRM 掃描的特征離子碎片的質(zhì)荷比（通過(guò)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，選取3 個(gè)干擾較少、豐度比較高的離子作為特征離子）及保留時(shí)間。通過(guò)對(duì)檢出限、假陽(yáng)性率以及基質(zhì)效應(yīng)的考察（如圖1、表3和表4 所示），該方法具有高特異性、高靈敏度、高精確度及較好的穩(wěn)健度（保留時(shí)間較為穩(wěn)定），且滿(mǎn)足WADA 對(duì)小肽類(lèi)物質(zhì)MRPL（2 ng/mL）的要求。此方法為直接進(jìn)樣分析，因此無(wú)需考察回收率。

表3 主要質(zhì)譜參數(shù)（Full scan和PRM）及保留時(shí)間

圖1 含42種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)的陽(yáng)性質(zhì)量控制樣品（QCP）的UHPLC/HRMS PRM譜圖

2.2.1 檢出限

選擇不同性別、比重（1.005～1.030）、pH（5～9）的空白尿樣（不少于10 份），分別取1.5 mL，并加入42 種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，濃度均為MRPL 水平，混勻后按上述直接進(jìn)樣方法進(jìn)行前處理，分別取150 μL 和50μL 上清液轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，各加入150 μL樣品稀釋溶液，渦旋混勻后，進(jìn)樣分析，當(dāng)信噪比S/N＞3則認(rèn)為檢出，與尿樣總數(shù)相比，若檢出率大于90%（即假陰性率≤10%），則該濃度水平為該目標(biāo)化合物的檢出限（limit of detection，LOD）。由表4 可以看出，在MRPL濃度下，42種目標(biāo)化合物的檢出率均大于90%。而在1/2MRPL 的濃度下，除了Alexamorelin、AOD-9604-metabolite （7-16）、Deslorelin、GHRP-4、Nafarelin 外，其余目標(biāo)化合物的檢出率也均大于90%。42種小肽類(lèi)目標(biāo)化合物檢出限的相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.2 假陽(yáng)性率的計(jì)算

取不同性別、比重（1.005～1.030）、pH（5～9）的空白尿樣（不少于20 份），加入內(nèi)標(biāo)，進(jìn)行直接進(jìn)樣方法前處理后，進(jìn)樣分析。統(tǒng)計(jì)每種禁用物質(zhì)在確定的保留時(shí)間的窗口內(nèi)出現(xiàn)明顯干擾的樣品個(gè)數(shù)（信噪比S/N＞3）與尿樣總數(shù)相比，即為假陽(yáng)性率，相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2.3 基質(zhì)效應(yīng)的計(jì)算

另取300 μL 樣品稀釋溶液，并加入MRPL 水平的相同禁用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，混勻后進(jìn)樣分析。通過(guò)對(duì)比前處理樣品分析物的峰面積（A）和加在流動(dòng)相標(biāo)準(zhǔn)溶液中分析物的峰面積（B）來(lái)評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，按以下公式計(jì)算：基質(zhì)效應(yīng)=（A/內(nèi)標(biāo)峰面積）÷（B/內(nèi)標(biāo)峰面積）× 100%。相關(guān)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 42種小肽類(lèi)目標(biāo)化合物的假陰性率、假陽(yáng)性率、檢出限以及基質(zhì)效應(yīng)

（續(xù)表4）

3 討論

通過(guò)上述結(jié)果可以看出，直接進(jìn)樣方法可以保留更多樣品信息，不會(huì)因?yàn)樘崛?、純化和預(yù)處理的過(guò)程，造成丟失部分樣品信息，尤其是那些在SPE 提取過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)信息大量損失的目標(biāo)化合物，如LHRH（1-3）-OH、ARA-290等，這樣可以更好地覆蓋不同的小肽類(lèi)物質(zhì)。對(duì)于一些目標(biāo)化合物，保留更多信息使其半峰寬變窄，峰高增大，峰型效果變好，審閱報(bào)告時(shí)更容易判斷。而且由于直接進(jìn)樣方法簡(jiǎn)單，無(wú)需大量的試劑，步驟少，處理方式快速，這樣可以節(jié)省人力物力，同時(shí)降低了前處理過(guò)程中可能引入的誤差。該方法可以快速處理大量樣品，避免樣品積壓導(dǎo)致的長(zhǎng)時(shí)間存放產(chǎn)生的微生物降解等問(wèn)題的發(fā)生。

然而，由于樣品未經(jīng)過(guò)提取純化的處理，直接稀釋后進(jìn)樣，樣品中含有更多的雜質(zhì)，導(dǎo)致譜圖中噪音增大，對(duì)有些目標(biāo)化合物的信噪比影響也隨之增大，致使一些目標(biāo)化合物在低濃度時(shí)，出峰效果不好，干擾較多。同時(shí)，未經(jīng)提取純化的樣品，也會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)變大，從而對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。因此，對(duì)于一些小肽類(lèi)禁用物質(zhì)，如AOD-9604，GHRP-2 等，本方法在MRPL濃度下尚不足以完成常規(guī)檢測(cè)。在以后的實(shí)驗(yàn)中，仍需考慮將SPE方法和直接進(jìn)樣方法的前處理程序相結(jié)合，以達(dá)到對(duì)不同小肽類(lèi)禁用物質(zhì)及其代謝物的廣泛覆蓋，提供更高特異性及高效率的初篩檢測(cè)方法。另一方面，由于直接進(jìn)樣方法中尿液樣品中含有大量雜質(zhì)（如尿蛋白、大肽等），盡管本方法已使用離心后尿液樣品的上清液，但比起純化后的樣品，本方法還是更容易堵塞液相色譜柱。

4 總結(jié)

綜上所述，直接進(jìn)樣的前處理方法，使得樣品前處理的程序變得簡(jiǎn)單、高效，同時(shí)因?yàn)椴捎昧薗 Exactive Plus UHPLC/HRMS，所以盡可能多地保留了較高的檢測(cè)靈敏度和特異性。本研究對(duì)該方法的檢出限、基質(zhì)效應(yīng)等都進(jìn)行了考察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的條件易于控制，結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)于本次研究的42 種小肽類(lèi)禁用物質(zhì)或其代謝物，均可以完成常規(guī)檢測(cè)，并能滿(mǎn)足WADA對(duì)此類(lèi)藥品檢測(cè)能力的要求。