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    響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取肉豆蔻總黃酮工藝及其抗氧化活性研究

    2021-11-17 06:59:12卓微偉李鳳胡君
    食品研究與開發(fā) 2021年19期
    關(guān)鍵詞:肉豆蔻黃酮類清除率

    卓微偉,李鳳,胡君

    (江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院,江蘇 鹽城 224005)

    肉豆蔻(Myristica fragrans Houtt.)是肉豆蔻科肉豆蔻屬植物的成熟種仁,可除異味、增辛香,常作為調(diào)味料用于肉品的鹵制和醬肉的加工中[1]。同時(shí),肉豆蔻也是我國常用的中藥材之一,其生理功能包括抑菌、抗癌、降血糖、抗衰老、保護(hù)肝臟等,而這些生理功能都與肉豆蔻含有的多種抗氧化活性物質(zhì)有關(guān)[2-3]。

    黃酮類化合物主要是指具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物,是一種多酚類植物次級代謝產(chǎn)物,因其具有多種較好的生理功能而備受關(guān)注[4-5]。黃酮類化合物的提取方式主要包括堿溶酸沉法、超聲輔助提取法、酶解法等,其中超聲輔助提取法是通過超聲波產(chǎn)生的機(jī)械破碎作用、空化效應(yīng)以及熱效應(yīng)破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu),進(jìn)而加快細(xì)胞內(nèi)含物釋放的一種提取技術(shù),具有提取率高、耗時(shí)少、提取物結(jié)構(gòu)不易被破壞等優(yōu)點(diǎn),被廣泛運(yùn)用于黃酮類化合物的提取中[6-8]。目前,國內(nèi)外對于肉豆蔻的研究主要集中在對其揮發(fā)油[9]、木脂素[10]、多酚[11]等的提取及成分分析,關(guān)于肉豆蔻中總黃酮的提取及抗氧化活性的研究卻鮮有報(bào)道。

    本研究擬采用超聲輔助法對肉豆蔻總黃酮進(jìn)行提取,并以總黃酮得率為評價(jià)指標(biāo),利用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)確定提取工藝的最佳參數(shù)。最后利用Fenton反應(yīng)法、鄰苯三酚自氧化法和1,1-二苯基-2-三硝基苯肼比色法分別評價(jià)肉豆蔻總黃酮對羥基自由基(·OH)、超氧陰離子自由基(O2-·)和 DPPH 自由基的清除能力,以期為肉豆蔻的多方向利用和功能活性的研究提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    肉豆蔻:市售,4℃保藏備用。

    蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品:蘇州天可貿(mào)易有限公司;亞硝酸鈉、硝酸鋁:鄒平天鹿化工有限公司;無水乙醇、水楊酸、硫酸亞鐵、鹽酸、鄰苯三酚、氫氧化鈉、無水碳酸鈉(均為分析純):天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;過氧化氫、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(均為分析純):洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

    1.2 儀器與設(shè)備

    電子天平(FA2004B型):上海精密科學(xué)儀器有限公司;真空干燥箱(DZF-6020型):南京優(yōu)豐干燥設(shè)備有限公司;高速多功能粉碎機(jī)(DFY-400C型):溫嶺市林大機(jī)械有限公司;紫外分光光度計(jì)(756PC型):湖南力辰儀器科技有限公司。

    1.3 方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

    參考陳蘇丹等[12]的方法,準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品,用70%乙醇溶解并定容至100 mL,得質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。依次吸取上述標(biāo)準(zhǔn)液0、1、2、3、4、5 mL 于試管中,向其中加入 5%NaNO2溶液及10%Al(NO3)3溶液各0.5 mL,搖勻后反應(yīng)6 min,隨后加入4%NaOH溶液4 mL,混合均勻,并用70%乙醇定容至10 mL,在25℃下靜置15 min后,于510 nm處測定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.180 2x-0.054 1(R2=0.974 7)。

    1.3.2 肉豆蔻總黃酮提取及含量測定

    精密稱取10 g經(jīng)干燥粉碎后的肉豆蔻粉末,按一定的乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比進(jìn)行提取,抽濾后得到肉豆蔻總黃酮提取液,按標(biāo)準(zhǔn)曲線相同操作測定肉豆蔻總黃酮的吸光度,利用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出提取液中總黃酮的濃度,并利用下面公式計(jì)算肉豆蔻總黃酮的得率。

    W/%=C×V/M×100

    式中:W為肉豆蔻總黃酮得率,%;C為總黃酮的濃度,mg/mL;V為濾液體積,mL;M為肉豆蔻質(zhì)量,mg。

    1.3.3 單因素試驗(yàn)

    以總黃酮得率為指標(biāo),采用控制變量法考察乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%)、超聲溫度(60、70、80、90、100 ℃)、超聲時(shí)間(20、30、40、50、60 min)和料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)]對肉豆蔻總黃酮得率的影響。

    1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),以肉豆蔻總黃酮得率為響應(yīng)值,利用Design-Expert 8.0.6.1軟件設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn),優(yōu)化肉豆蔻總黃酮提取工藝,試驗(yàn)因素與水平見表1。

    表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface test

    1.3.5 抗氧化活性試驗(yàn)

    分別配制濃度為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的肉豆蔻總黃酮提取液,以相同濃度的VC作為陽性對照,采用Fenton反應(yīng)法[13]、鄰苯三酚自氧化法[14]和DPPH比色法[15]測定其對·OH、O2-·和DPPH 自由基的清除率,從而評價(jià)肉豆蔻總黃酮的抗氧化活性。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用Office2010對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,利用Design-Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析,每組試驗(yàn)重復(fù)3次并取平均值。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1 乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響

    選取乙醇濃度為50%、60%、70%、80%、90%,分析乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響,結(jié)果如圖1所示。

    圖1 乙醇濃度對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

    由圖1可知,肉豆蔻總黃酮得率隨著乙醇濃度的升高先增大后緩慢減小,且當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí),肉豆蔻總黃酮的得率最高。這是由于總黃酮類物質(zhì)的溶出與提取溶劑的極性有關(guān),隨著乙醇濃度的升高,肉豆蔻總黃酮與乙醇的極性逐漸接近,總黃酮類物質(zhì)溶出增多。但是乙醇濃度過高,溶劑極性減小,阻礙了部分黃酮苷的溶解,并且造成其它醇溶性雜質(zhì)及色素等物質(zhì)的大量溶出,從而加速了其它物質(zhì)與總黃酮類物質(zhì)的溶出競爭[16],總黃酮得率有所下降。因此乙醇的最適濃度為80%。

    2.1.2 超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響

    選取超聲溫度為 60、70、80、90、100 ℃,分析超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響,結(jié)果如圖2所示。

    圖2 超聲溫度對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

    由圖2可知,隨著超聲溫度的增加,肉豆蔻總黃酮得率先增大后減小,且當(dāng)超聲溫度為80℃時(shí),總黃酮得率最高。這是因?yàn)闇囟鹊纳呒涌炝朔肿娱g的運(yùn)動(dòng),總黃酮類物質(zhì)在提取溶劑中的擴(kuò)散、溶解能力增強(qiáng),溶出量增多。然而溫度過高時(shí),提取溶劑揮發(fā)加劇,乙醇濃度降低,影響提取效果。此外,過高的溫度容易破壞總黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu),同時(shí)加速了黃酮醇類等物質(zhì)的分解速率及其它黃酮類化合物的氧化、縮合、降解等反應(yīng)[17-18],總黃酮得率下降。因此最佳超聲溫度為80℃。

    2.1.3 超聲時(shí)間對肉豆蔻總黃酮得率的影響

    選取超聲時(shí)間為 20、30、40、50、60 min,分析超聲時(shí)間對肉豆蔻總黃酮得率的影響,結(jié)果如圖3所示。

    圖3 超聲時(shí)間對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

    由圖3可知,肉豆蔻總黃酮的得率隨著超聲時(shí)間的延長先增大后減小,且當(dāng)超聲時(shí)間為50 min時(shí),總黃酮得率最高。這可能是黃酮類化合物大多存在于肉豆蔻的細(xì)胞膜中,在超聲波的作用下,植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞,分子運(yùn)動(dòng)速率加快,總黃酮類物質(zhì)不斷溶出,總黃酮得率增加[19]。但是超聲時(shí)間過長,其產(chǎn)生的機(jī)械作用和空化效應(yīng)會(huì)對總黃酮結(jié)構(gòu)造成一定程度的破壞,從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[20]。因此,超聲時(shí)間以50 min為宜。

    2.1.4 料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響

    選取料液比為 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 (g/mL),分析料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響,結(jié)果如圖4所示。

    圖4 料液比對肉豆蔻總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

    由圖4可知,隨著溶劑用量的增加,肉豆蔻總黃酮的得率逐漸增加,且當(dāng)料液比為1∶40(g/mL)時(shí)達(dá)到最高,之后逐漸趨于穩(wěn)定。這是由于增大溶劑用量,肉豆蔻粉末與提取溶劑能夠充分接觸,有利于總黃酮類物質(zhì)從肉豆蔻內(nèi)部向溶劑中擴(kuò)散,總黃酮得率提高。但是當(dāng)料液比達(dá)到一定程度時(shí),總黃酮類物質(zhì)已基本溶出,此時(shí)若繼續(xù)增加溶劑用量,不僅容易造成雜質(zhì)的溶解,還會(huì)增加溶劑成本[21]。因此,最佳的料液比為1∶40(g/mL)。

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

    2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

    結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,以肉豆蔻總黃酮得率為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面試驗(yàn)對肉豆蔻總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,其試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步對回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果如表3所示。

    表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface test results

    續(xù)表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Continue table 2 Response surface test results

    表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

    使用響應(yīng)面分析軟件對表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,得到以總黃酮得率為響應(yīng)值的回歸方程:Y=2.43-0.097A+0.085B+0.054C-0.022D-0.015AB+0.042AC+0.52AD+0.24BC-0.18BD+0.26CD-0.25A2-0.59B2-0.25C2-0.50D2。

    由表3可知,模型極顯著(P<0.01),失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05),說明該模型誤差小。R2值為 0.952 7,R2adj值為0.905 5,CV為7.69%,說明模型擬合度良好,進(jìn)一步說明該模型的可靠性,并可將其用于肉豆蔻總黃酮得率的預(yù)測和分析。顯著性分析檢驗(yàn)結(jié)果顯示,AD、BC、CD、A2、B2、C2、D2項(xiàng)對總黃酮得率均有極顯著影響,A、B、BD 項(xiàng)對肉豆蔻總黃酮得率影響顯著,C、D、AB、AC項(xiàng)對肉豆蔻總黃酮得率影響不顯著。根據(jù)F值可知,4個(gè)因素對肉豆蔻總黃酮得率的影響順序?yàn)橐掖紳舛龋ˋ)>超聲溫度(B)>超聲時(shí)間(C)>料液比(D)。

    2.2.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖分析

    為考察各因素交互作用對肉豆蔻總黃酮得率的影響,通過Design-Expert 8.0.6.1軟件繪制相應(yīng)的響應(yīng)面圖,結(jié)果如圖5所示。

    圖5 各因素交互作用對肉豆蔻總黃酮得率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of the influence of the interaction of various factors on the extraction yield of total flavonoids from nutmeg

    響應(yīng)曲面的陡峭程度可以反映各因素值的變化對于響應(yīng)值的影響大小。由圖5可知,交互項(xiàng)AD(圖5c)、CD(圖 5f)、BC(圖 5d)和 BD(圖 5e)的響應(yīng)曲面坡度較為陡峭,且等高線呈橢圓形或馬鞍形,說明乙醇濃度與料液比、超聲時(shí)間與料液比、超聲溫度與超聲時(shí)間、超聲溫度與料液比的交互作用均顯著,對肉豆蔻總黃酮得率的影響較大;而其它項(xiàng)的響應(yīng)曲面圖坡度較平緩,表明其交互作用不顯著,這與表3中回歸方程的方差分析結(jié)果一致。

    2.2.3 驗(yàn)證性試驗(yàn)

    根據(jù)響應(yīng)面回歸模型預(yù)測可得肉豆蔻總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度73.73%,超聲溫度81.25℃,超聲時(shí)間 49.11 min,料液比 1∶36.03(g/mL),此時(shí)肉豆蔻總黃酮得率預(yù)測值為2.466%。為方便試驗(yàn)操作,確定其最終提取工藝條件為乙醇濃度74%,超聲溫度81 ℃,超聲時(shí)間 49 min,料液比 1∶36(g/mL),并在此最優(yōu)組合下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn),得到肉豆蔻總黃酮得率平均值為2.503%,與預(yù)測值相近,進(jìn)一步證明了該模型的可信性。

    2.3 肉豆蔻總黃酮的抗氧化活性

    2.3.1 肉豆蔻總黃酮對·OH的清除作用

    以VC為陽性對照,肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率結(jié)果如圖6所示。

    圖6 肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率Fig.6 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for·OH

    由圖6可知,肉豆蔻總黃酮對·OH的清除率隨著其濃度的增加呈上升趨勢,當(dāng)肉豆蔻總黃酮濃度達(dá)到0.5 mg/mL時(shí),其對·OH的清除率為85.78%,略低于同濃度下的VC對·OH的清除能力。這是由于黃酮化合物含有具備供氫及供電子能力的酚羥基、C4酮羰基等結(jié)構(gòu),其提供的氫原子能與·OH結(jié)合,終止自由基的氧化損傷反應(yīng),從而達(dá)到清除·OH的效果[22]。

    2.3.2 肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除作用

    O2-·活潑性較強(qiáng),與機(jī)體的氧化損傷有著密切的聯(lián)系,是評價(jià)抗氧化活性的一項(xiàng)重要指標(biāo)。不同濃度的肉豆蔻總黃酮與VC對O2-·清除率的測定結(jié)果如圖7所示。

    圖7 肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除率Fig.7 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for O2-·

    由圖7可知,隨著肉豆蔻總黃酮濃度的增加,其對O2-·的清除率也不斷增加,且0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對O2-·的清除率為88.31%,與同濃度的VC相比,其清除能力略低。然而由于VC本身是一種強(qiáng)氧化劑,因此可認(rèn)定肉豆蔻總黃酮具有較好的清除O2-·的能力。

    2.3.3 肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除作用

    不同濃度的肉豆蔻總黃酮和VC對DPPH自由基的清除率結(jié)果如圖8所示。

    圖8 肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of total flavonoids from nutmeg for DPPH free radical

    由圖8可知,肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率隨著其濃度的升高而不斷增加,且0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基的清除率為92.31%,與等濃度的VC對DPPH自由基的清除能力相近,可見肉豆蔻總黃酮對DPPH自由基具有較強(qiáng)的清除能力。

    3 結(jié)論

    本研究探討了肉豆蔻總黃酮的最佳超聲輔助提取工藝參數(shù)及其抗氧化活性。結(jié)果表明,肉豆蔻總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)為乙醇濃度74%、超聲溫度81 ℃、超聲時(shí)間 49 min、料液比 1∶36(g/mL),在此工藝條件下,肉豆蔻總黃酮的得率為2.503%。此外,抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示,0.5 mg/mL的肉豆蔻總黃酮對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除率分別為85.78%、88.31%和92.31%,略低于同濃度的VC的抗氧化能力,但仍表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。然而本試驗(yàn)也有不足之處,如試驗(yàn)得到的肉豆蔻總黃酮僅為粗提物,還需進(jìn)一步的純化才能發(fā)揮更好的功效,提取物中具體的組成成分及其它的功能活性也需深入研究。

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