Thermoplasma volcanium來(lái)源β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)分析

劉 陽(yáng)，王 丹，紀(jì) 銳，顧少華，李繼喜，季朝能

(1. 復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438； 2. 復(fù)旦大學(xué) 遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

當(dāng)前全球能源負(fù)擔(dān)和化石燃料的需求正在增加，化石燃料的使用還以污染物的形式帶來(lái)了各種環(huán)境危害.國(guó)際能源署(IEA)發(fā)布報(bào)告稱(chēng)生物能源是增長(zhǎng)最快的能源，從2018年到2023年，可再生能源消費(fèi)領(lǐng)域中生物能源的增長(zhǎng)率約為30%[1].盡管人類(lèi)已積極開(kāi)發(fā)利用太陽(yáng)能、水力能、風(fēng)能等能源形式，但由于對(duì)氣候環(huán)境的依賴(lài)性，仍不能確保穩(wěn)定的能源生產(chǎn)和供應(yīng)[2].在這種情況下，生物質(zhì)降解和轉(zhuǎn)化為生物能源似乎是有益而有前途的選擇.纖維素是生物質(zhì)最為主要的成分之一，高效環(huán)保地分解纖維素獲得葡萄糖的過(guò)程是有效利用生物質(zhì)的關(guān)鍵[3].

纖維素酶是由3種不同的酶組成的系統(tǒng)，包含外切葡聚糖酶、內(nèi)切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶(BGL)，它們?cè)谒饫w維素的過(guò)程中具有不同的功能，起著協(xié)同作用.內(nèi)切葡聚糖酶隨機(jī)作用于纖維素的內(nèi)部并切割葡萄糖的線性鏈，產(chǎn)生兩個(gè)新的短糖鏈[4]；然后，外切葡聚糖酶作用于這兩個(gè)短糖鏈暴露的末端，使纖維二糖和一些葡萄糖脫離；最后，β-葡萄糖苷酶將纖維二糖和纖維寡糖分解為葡萄糖分子.

β-葡萄糖苷酶(E.C.3.2.1.21)是一種水解糖苷鍵以從糖苷和寡糖中釋放非還原性末端糖苷殘基的酶.這些酶在古細(xì)菌、真細(xì)菌和真核生物中普遍存在并發(fā)揮多種功能.包括微生物的生物能轉(zhuǎn)化、動(dòng)物體內(nèi)糖脂和外源糖苷的分解、纖維素低聚糖的木質(zhì)化、分解代謝、防御、植物激素偶聯(lián)活化和植物氣味釋放等[5].由于β-葡萄糖苷酶在自然界中具有多樣化的功能，因此衍生出多種分類(lèi)方式.常見(jiàn)的分類(lèi)方法如下[6-9]： 1) 基于底物特異性；2) 基于蛋白質(zhì)序列相似性和酶的空間結(jié)構(gòu)；3) 基于催化機(jī)理；4) 基于產(chǎn)物耐受性.1999年建立的碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)(CAZy)，主要基于蛋白質(zhì)序列相似性和酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類(lèi)，至今仍被廣泛使用.根據(jù)CAZy的統(tǒng)計(jì)，目前β-葡萄糖苷酶主要分布在糖苷水解酶家族1、2、3、5、9、16、30、39和116中.

由于β-葡萄糖苷酶的低效率和潛在的BGL生產(chǎn)者微生物的缺乏，纖維素向糖的總轉(zhuǎn)化率通常較低，這就使得轉(zhuǎn)化成本較高.因此，研究人員一方面一直在研究不同的真菌和細(xì)菌菌株，以獲得有效的分解纖維素的β-葡萄糖苷酶[10]；另一方面則重點(diǎn)關(guān)注該酶的水解速率、抑制劑、穩(wěn)定性、產(chǎn)物抑制和熱不穩(wěn)定性等關(guān)鍵因素.其中水解和產(chǎn)物抑制作為限速步驟被廣泛研究.據(jù)報(bào)道，已經(jīng)存在描述嗜熱和熱穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酶的研究，如Fusco等[1]通過(guò)編碼基因Dtur_0462合成來(lái)源于Dictyoglomusturgidum的β-葡萄糖苷酶，在大腸桿菌中表達(dá)了熱穩(wěn)定的β-葡萄糖苷酶DturβGlu，在80 ℃時(shí)該酶有最大活性，70 ℃下孵育2 h后有70%的活性.Sun等[12]在大腸桿菌中表達(dá)了來(lái)自于marinebacterium的GH1 β-葡萄糖苷酶，該酶對(duì)葡萄糖有高度耐受性，并在葡萄糖濃度為100 mmol/L時(shí)顯示最大的刺激活性；在40 ℃，pH7.5時(shí)表現(xiàn)最佳活性.但同時(shí)具備良好的耐糖和耐熱特性的β-葡萄糖苷酶種類(lèi)卻不多.另外，由于β-葡萄糖苷酶的底物纖維二糖是內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的強(qiáng)抑制劑，而β-葡萄糖苷酶本身被高濃度的產(chǎn)物葡萄糖抑制，使得它成為整個(gè)水解過(guò)程中的限速酶.因此，尋找耐受葡萄糖的高反應(yīng)活性β-葡萄糖苷酶，同時(shí)提高該酶的生產(chǎn)率，變得至關(guān)重要.

火山嗜熱菌Thermoplasmavolcanium是從酸性熱液噴口和硫質(zhì)氣孔(solfatara)中分離出來(lái)的嗜熱古菌，它是兼性厭氧的化能異養(yǎng)菌[13]，該古菌中的大多數(shù)酶具有嗜熱特性.在本文中，研究報(bào)道了一種來(lái)源于Thermoplasmavolcanium的BGL，并詳細(xì)描述了其酶學(xué)特性，為進(jìn)一步的工業(yè)應(yīng)用和改造提供了方向.

1 材料和方法

1.1 材料和主要試劑

菌株E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)PlysS均由本實(shí)驗(yàn)室保存.重組原核表達(dá)載體pET22-TvBGL由本實(shí)驗(yàn)室合成并保存.Ulp1酶由本實(shí)驗(yàn)室純化并保存.蛋白超濾管Amicon-Ultra 30 kDa購(gòu)自Millipore公司.鎳親和層析柱HisTrapTMHP和DEAE陰離子交換柱HiTrapTMDEAE FF購(gòu)自GE Healthcare公司.96孔酶標(biāo)板購(gòu)自NEST公司，96孔結(jié)晶坐滴板CrystalQuickTMPlus和24孔結(jié)晶板VDXmTMPlate購(gòu)自Hampton Research公司.葡萄糖含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio公司.有機(jī)溶劑、去垢劑、金屬離子測(cè)定試劑購(gòu)自Hampton Research公司.檸檬酸、磷酸氫二鈉、纖維二糖和對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷均購(gòu)自Sigma公司.

1.2 方法

1.2.1 Tv-BGL的克隆，蛋白表達(dá)和純化

Tv-BGL氨基酸序列號(hào)WP_010916943.1，通過(guò)基因合成技術(shù)合成靶基因，得到構(gòu)建的pET22-TvBGL重組表達(dá)載體.測(cè)序證實(shí)插入物正確后，將載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌E.coliBL21(DE3)PlysS中，使細(xì)菌在37 ℃條件下，在含有34 μg/mL氯霉素和50 mg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，直至OD600達(dá)到0.8，此時(shí)，向培養(yǎng)基中添加終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，以誘導(dǎo)重組BGL的表達(dá).在20 ℃誘導(dǎo)10 h后，4 ℃，5 000×g離心5 min收集細(xì)胞.使用裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，pH 8.0)以10 mL/g的比例將收集的細(xì)胞重懸.然后，使用聚能高壓細(xì)胞破碎儀在1 200 bar的壓力下將其破碎兩次，4 ℃，13 000×g離心40 min除去細(xì)胞碎片.將得到的上清液在65 ℃下熱處理30 min，13 000×g離心10 min以除去沉淀物.使得到的上清液通過(guò)用裂解液平衡的HisTrapTMNi-NTA色譜柱(GE Healthcare)后，利用洗脫緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，200 mmol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，pH 8.0)線性洗脫(50～500 mmol/L咪唑，10 mL)帶有6×His標(biāo)簽和SUMO標(biāo)簽的Tv-BGL，加入U(xiǎn)lpl酶在4 ℃酶切過(guò)夜.第2次通過(guò)Ni-NTA柱后，獲得脫掉標(biāo)簽的Tv-BGL，將用DEAE結(jié)合緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，pH8.0)稀釋的目的蛋白溶液通過(guò)DEAE柱(GE Healthcare)，并使用DEAE洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl 500 mmol/L NaCl，pH 8.0)線性洗脫(0～500 mmol/L NaCl，50 mL).通過(guò)使用30 kDa的蛋白超濾管(Millipore)更換并濃縮液體，將濃縮的Tv-BGL儲(chǔ)存在由20 mmol/L Tris-HCl(pH8.0)組成的緩沖液中，通過(guò)Bradford分析確定Tv-BGL的濃度，并通過(guò)12% SDS-PAGE分析蛋白質(zhì)的純度.最后將濃縮的Tv-BGL在液氮中冷凍并保存在-80 ℃的冰箱中.

1.2.2 Tv-BGL酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

下述以pNPGlu為底物的酶學(xué)測(cè)定均采用200 μL的反應(yīng)體系，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中，底物對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)終濃度為1 mmol/L，加入適當(dāng)濃度的酶，混合均勻后反應(yīng)10 min，反應(yīng)終止時(shí)用1 mol/L等體積的Na2CO3溶液終止反應(yīng).所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，并使用多功能酶標(biāo)儀(Biotek)在410 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值[14].

1) pH和溫度對(duì)酶活力的影響： 在不同pH(3.0～8.0)檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中進(jìn)行酶促反應(yīng)，以確定酶的最適反應(yīng)pH；在不同溫度(60～100 ℃)下進(jìn)行水浴，確定最適反應(yīng)溫度.在最適溫度下，將酶分別在pH(3.0～8.0)的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中孵育1 h，測(cè)定pH穩(wěn)定性；在最適pH下，將酶分別在75 ℃、80 ℃、85 ℃下分別孵育30，60，90 min，測(cè)定熱穩(wěn)定性.

2) 酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定： (1) 以pNPGlu為底物的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定，在最適反應(yīng)pH和溫度下，保持加入反應(yīng)的酶量不變，改變底物pNPGlu濃度，分別在0.0，0.2，0.4，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0 mmol/L的終濃度下反應(yīng)3 min，在410 nm處測(cè)定吸光值，1U定義為在此條件下1 min內(nèi)從pNPGlu釋放1 μmol對(duì)硝基苯酚.(2) 以纖維二糖為底物的酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定，在最適反應(yīng)pH和溫度下，保持加入反應(yīng)的酶量不變，改變底物纖維二糖的濃度，分別在0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，10，15，20，25，30，40，60，80，100，150 mmol/L的終濃度下反應(yīng)10 min，利用GOD-POD法，在505 nm波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值，1U定義為在此條件下1 min內(nèi)從纖維二糖釋放1 μmol葡萄糖.使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software，Inc. CA，USA)通過(guò)Michaelis-Menten方程非線性擬合計(jì)算出Km，Vmax，和Kcat動(dòng)力學(xué)參數(shù).

3) 金屬離子，去垢劑和有機(jī)溶劑對(duì)酶活力的影響： 在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的Ba2+，Cd2+等13種金屬離子，n-Dodecyl-β-D-maltoside(DDM)等8種去垢劑，甘油等25種有機(jī)溶劑進(jìn)行金屬離子，去垢劑和有機(jī)溶劑耐受性測(cè)定.

4) 酶的底物特異性： 以纖維二糖，蔗糖，乳糖，麥芽糖，羧甲基纖維素(CMC)為底物，將緩沖液稀釋的酶與底物在最適反應(yīng)pH和溫度下，反應(yīng)10 min，利用GOD-POD法，測(cè)505 nm波長(zhǎng)處吸光度值，計(jì)算產(chǎn)物葡萄糖濃度.

5) 葡萄糖對(duì)酶活力的影響： 產(chǎn)物抑制分析測(cè)定在最佳pH和最佳溫度下使用pNPGlu作為底物，分別向反應(yīng)系統(tǒng)中添加不同濃度的葡萄糖溶液，從而系統(tǒng)中的最終濃度為0.1，0.25，0.5，1，1.5，2，2.5和2.625 mol/L，反應(yīng)10 min，在終止反應(yīng)后測(cè)量殘留的酶活力，并使用對(duì)數(shù)法計(jì)算半抑制濃度IC50.

2 結(jié)果與分析

2.1 Tv-BGL同源家族酶類(lèi)比對(duì)分析

利用氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的UniProt/Swiss-Prot(Swissprot)數(shù)據(jù)庫(kù)中運(yùn)行BlASTp工具進(jìn)行蛋白序列相似性檢索，與數(shù)據(jù)庫(kù)中氨基酸序列同源性比較高的有來(lái)源于SaccharolobussolfataricusP2、Saccharolobusshibatae、SulfolobusacidocaldariusDSM639的β-葡萄糖苷酶，同源性分別為58.20%、58.11%、55.42%(圖1).為了揭示Tv-BGL潛在的催化活性位點(diǎn)，選取了不同來(lái)源的糖苷水解酶家族1(GH1)的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行比對(duì).從PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中選取古細(xì)菌Saccharolobussolfataricus(ATCC 35092/DSM 1617/JCM 11322/P2)的1GOW，細(xì)菌Paenibacilluspolymyxa的6QWI，Lactobacillusplantarum(ATCC BAA-793/NCIMB 8826/WCFS1)的5NAQ，真菌Trichodermaharzianum的6EFU和5JBO，小麥Triticumaestivum的2DGA，草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的5CG0，結(jié)果如圖2所示.比對(duì)基于Tv-BGL的晶體結(jié)構(gòu)，利用SnapGene中的Clustal Omega進(jìn)行對(duì)齊，后續(xù)使用ESPript 3.0(http：∥espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi)網(wǎng)站對(duì)序列比對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖[15]，結(jié)果顯示了幾段高度保守的區(qū)域，其中氨基酸Glu205，Glu380及前后氨基酸區(qū)域(圖中☆標(biāo)示)高度保守，表明Tv-BGL屬于糖苷水解酶1家族且遵循保守催化機(jī)制，而這些保守的氨基酸殘基則可能是參與酶催化的催化位點(diǎn)和輔助位點(diǎn).

圖1 BLASTp蛋白序列相似性檢索結(jié)果Fig.1 BLASTp protein sequence similarity searching result

圖2 Tv-BGL與多來(lái)源GH1家族β-葡萄糖苷酶多重序列比對(duì)圖Fig.2 Multiple sequence alignment of Tv-BGL with multi-source GH1 family β-glucosidase紅色五角星表示高度保守的區(qū)域.

2.2 Tv-BGL的表達(dá)和純化

構(gòu)建了Tv-BGL基因的表達(dá)質(zhì)粒，在大腸桿菌中可溶性表達(dá)量大.通過(guò)第1步熱處理，第2步Ni柱純化，第3步酶切，第4步DEAE柱純化，純化結(jié)果如圖3(見(jiàn)第640頁(yè))所示，與理論分子量55.2 kDa相符合，最后，通過(guò)蛋白超濾管(Millipore)將蛋白質(zhì)濃縮至25 mg/mL.

圖3 純化過(guò)程的SDS-PAGE結(jié)果Fig.3 SDS-PAGE results of purification process1: 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記；2: 全菌；3: 上清；4: 熱處理后上清； 5: 鎳親和層析流穿；6: 鎳親和層析洗脫；7: 酶切后；8: DEAE離子親和層析洗脫.

2.3 Tv-BGL的酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 β-葡萄糖苷酶活力的最佳條件

如圖4、圖5所示，酶活力的最佳條件為pH6.0和80 ℃.pH穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果(圖6)表明，在80 ℃孵育1 h后，在緩沖液pH6.0的條件下殘余活力最高為65%.熱穩(wěn)定性分析在pH6.0條件下，于75 ℃，80 ℃，85 ℃，分別溫育30，60，90 min后測(cè)定殘余酶活力.結(jié)果如圖7所示，在85 ℃時(shí)孵育30 min完全喪失酶活力，在75 ℃孵育30 min殘余68%的酶活力，孵育60 min殘余85%的酶活力、孵育90 min殘余66%的酶活力.在最適溫度80 ℃孵育30 min殘余54%的酶活力，孵育60 min殘余67%的酶活力，孵育90 min殘余33%的酶活力.可以看出孵育60 min時(shí)酶活力都有明顯上升，說(shuō)明Tv-BGL具有被熱激活的特性.

圖4 pH對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.4 The effect of pH on Tv-BGL enzyme activity

圖5 溫度對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.5 The effect of temperature on Tv-BGL enzyme activity

圖6 最適溫度下pH對(duì)酶穩(wěn)定性的影響Fig.6 The influence of pH on enzyme stability at optimum temperature

圖7 最適pH下酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of enzyme at optimum pH

2.3.2 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

在pH6.0，80 ℃條件下，保持加入反應(yīng)的酶量不變，改變底物濃度，測(cè)定反應(yīng)速率，通過(guò)使用Michaelis-Menten方程非線性擬合，計(jì)算得到以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)為底物的Vmax=614.60 U/mg(1U定義為1 μmol/min)，Km=0.725 4 mmol/L，Kcat=565.30 s-1(圖8(a)).以纖維二糖(Cellobiose)為底物的Vmax=636.06 U/mg(1U定義為1 μmol/min)，Km=55.63 mmol/L，Kcat=586.93 s-1(圖8(b))，表明Tv-BGL酶的催化速率較高.

圖8 Tv-BGL酶動(dòng)力學(xué)Fig.8 Enzyme kinetics of Tv-BGL

2.3.3 金屬離子對(duì)Tv-BGL酶活力的影響

據(jù)報(bào)道某些金屬離子和試劑會(huì)影響β-葡萄糖苷酶的活力，大部分的β-葡萄糖苷酶被重金屬抑制，例如Ag+，Cu2+，Hg2+，Zn2+，Mn2+[16].在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1 mmol/L的金屬離子鹽溶液，于最適反應(yīng)溫度80 ℃反應(yīng)10 min，測(cè)定不同金屬離子對(duì)Tv-BGL酶活力的影響.結(jié)果如圖9所示，除Na+抑制了12.43%的活力外，其他所有離子對(duì)Tv-BGL酶活力的抑制作用皆不超過(guò)10%，抑制作用小.此外，如圖10所示，在反應(yīng)緩沖液中添加EDTA對(duì)酶活力幾乎無(wú)影響，推測(cè)Tv-BGL不存在這些金屬離子的結(jié)合位點(diǎn)或者這些金屬離子的結(jié)合并不明顯影響Tv-BGL的三維結(jié)構(gòu)而導(dǎo)致催化能力的劇烈變動(dòng).

圖9 金屬離子對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.9 The effect of metal ions on Tv-BGL enzyme activity

圖10 EDTA對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.10 The effect of EDTA on Tv-BGL enzyme activity

2.3.4 去污劑對(duì)Tv-BGL酶活力的影響

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為1%(質(zhì)量濃度)的7種去污劑和終濃度為10 mmol/L的Sarosine，測(cè)定反應(yīng)酶活力.結(jié)果如圖11所示，實(shí)驗(yàn)的幾種去垢劑對(duì)Tv-BGL酶沒(méi)有明顯的激活作用，但抑制作用明顯，其中Trimethylamine N-oxide dihydrate(TMANO)對(duì)Tv-BGL具有輕微抑制作用，抑制了17.6%的活力，而n-Dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide(DDAO)抑制了酶54.1%的活力，n-Dodecyl-β-D-maltoside(DDM)抑制了酶72.2%的活力，SDS抑制了酶47%的活力，n-Octyl-β-D-glucoside(OG)抑制了酶97.5%活力.n-Octyl-β-D-glucoside具有很強(qiáng)的抑制能力，同時(shí)與底物纖維二糖有一定程度的相似性，可用于后續(xù)嘗試n-Octyl-β-D-glucoside與Tv-BGL復(fù)合物晶體的篩選來(lái)探討Tv-BGL的催化機(jī)制.

圖11 去污劑對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.11 The effect of detergent on Tv-BGL enzyme activity

2.3.5 有機(jī)溶劑對(duì)Tv-BGL酶活力的影響

在反應(yīng)體系中分別加入終濃度為2%(體積分?jǐn)?shù))或質(zhì)量濃度為20 mg/mL的24種有機(jī)溶劑以及10 mmol/L Phenol共25種有機(jī)溶劑，在最適反應(yīng)條件下同時(shí)反應(yīng)10 min.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12所示，不同的有機(jī)溶劑對(duì)Tv-BGL酶的活力影響較大，其中1,4-Butanediol(1,4-丁二醇)激活最明顯，相對(duì)酶活力146.90%，1,1,1,3,3,3-Hexafluoro-2-propanol(1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇)抑制最明顯，相對(duì)酶活力為45.06%.挑選激活能力前6位的有機(jī)溶劑，在不同濃度下進(jìn)行酶活力測(cè)定，結(jié)果如圖13所示.Glycerol、1,4-Butanediol、1,3-Propanediol、1-Propanol在合適濃度下均可達(dá)到激活50%左右酶活力的效果，這些起激活作用的有機(jī)溶劑在后續(xù)Tv-BGL的工業(yè)應(yīng)用中可根據(jù)情況選用.

圖12 有機(jī)溶劑對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.12 The effect of organic solvent on Tv-BGL enzyme activity

圖13 不同濃度有機(jī)溶劑對(duì)Tv-BGL 酶活力的影響Fig.13 Effects of different concentrations of organic solvents on Tv-BGL enzyme activity

2.3.6 底物特異性

β-葡萄糖苷酶底物特異性的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.β-葡萄糖苷酶對(duì)乳糖、蔗糖、麥芽糖、羧甲基纖維素(CMC)的酶解能力較弱，而對(duì)纖維二糖的酶解能力較強(qiáng).這說(shuō)明底物種類(lèi)對(duì)Tv-BGL的酶活力影響較大，Tv-BGL具有明顯底物特異性.

2.3.7 產(chǎn)物抑制分析

在反應(yīng)體系中分別加入不同濃度的β-葡萄糖溶液，使體系中β-葡萄糖終濃度在0.100～2.625 mol/L范圍，結(jié)果如圖14所示，低濃度的葡萄糖溶液對(duì)Tv-BGL酶起明顯激活的作用，葡萄糖終濃度0.100 mol/L 時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到149.84%，0.250 mol/L時(shí)相對(duì)酶活力達(dá)到150.86%.利用對(duì)數(shù)法計(jì)算對(duì)酶活力有50%抑制作用的濃度，得IC50為1.790 mol/L.抑制的程度隨葡萄糖濃度的增加而緩慢增加，直至葡萄糖濃度為2.500 mol/L時(shí)，相對(duì)酶活力仍達(dá)到30%，證明β-葡萄糖對(duì)Tv-BGL來(lái)說(shuō)不是一種好的抑制劑，但Tv-BGL的產(chǎn)物耐受性可能會(huì)有益于商業(yè)應(yīng)用效率.

圖14 葡萄糖對(duì)Tv-BGL酶活力的影響Fig.14 The effect of glucose on Tv-BGL enzyme activity

表1 β-葡萄糖苷酶對(duì)不同底物的選擇性

3 討 論

β-葡萄糖苷酶來(lái)源廣泛，普遍存在于生物體、古菌、真細(xì)菌和真核生物.哺乳動(dòng)物來(lái)源的GH1乳糖酶-phloridzin水解酶家族和細(xì)胞質(zhì)β-葡萄糖苷酶、GH30人酸性β-葡萄糖苷酶(GBA1)[17]和膽汁酸β-葡萄糖苷酶(GBA2)被認(rèn)為在糖脂和膳食糖苷的代謝中起重要作用[18].β-葡萄糖苷酶在植物中具有最廣泛的生物學(xué)功能，包括防御、共生、細(xì)胞壁分解代謝和連接、信號(hào)傳導(dǎo)以及植物次生代謝等.針對(duì)微生物中的β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在那些參與生物轉(zhuǎn)化以從植物生物質(zhì)中產(chǎn)生葡萄糖的酶，或參與突破植物細(xì)胞壁以建立致病性或共生關(guān)系的酶[19].因此，β-葡萄糖苷酶因?yàn)榉植紡V泛，且在不同領(lǐng)域大量應(yīng)用，受到了廣泛關(guān)注.

在本研究中，Tv-BGL來(lái)源于耐熱古生菌，它在pH6.0和80 ℃下發(fā)揮出最佳的催化活力.以對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPGlu)為底物的Km和Vmax分別為0.725 4 mmol/L和614.6 U/mg，Kcat/Km=7.6×105mol-1·L·s-1.該酶具有較高的熱穩(wěn)定性和葡萄糖耐受性，受金屬離子影響較小，且耐受多種有機(jī)溶劑和去垢劑，同時(shí)會(huì)受多種有機(jī)溶劑激活，表明該酶可以積極參與到工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化為糖的過(guò)程，在生物能源領(lǐng)域、食品飲料生產(chǎn)領(lǐng)域等具有潛在的應(yīng)用前景[20].

有科學(xué)家利用生物信息學(xué)對(duì)用于生物燃料生產(chǎn)的耐葡萄糖β-葡萄糖苷酶進(jìn)行分析.在大量的分析中，鑒定出極保守性殘基，出現(xiàn)在大多數(shù)序列中但保守性不高的殘基以及保守性很差的殘基.保守性表明殘基的重要性，這些殘基的任何突變就不能用于工程改造更有效的β-葡萄糖苷酶.通過(guò)初步的結(jié)晶蛋白結(jié)構(gòu)解析，發(fā)現(xiàn)Tv-BGL的活性口袋成員包括 Glu380、Glu205、Gln20、Glu425、Trp418、Asn423、Trp426、Trp150、His149、Asn204、Asn313 和 Tyr315，多個(gè)芳香基團(tuán)的存在形成了狹窄的通道.據(jù)研究，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)葡萄糖耐受的氨基酸通常存在在通往活性位點(diǎn)的通道中，葡萄糖耐受的GH1 β-葡萄糖苷酶呈現(xiàn)出一條狹窄的深通道，限制了葡萄糖進(jìn)入活性位點(diǎn)[21].通道形狀將底物引導(dǎo)至活性位點(diǎn)，并且其負(fù)責(zé)減少葡萄糖的進(jìn)入，從而影響GH1 β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐量[22].

近年來(lái)，發(fā)掘新的葡萄糖苷酶的重點(diǎn)在于其實(shí)際應(yīng)用價(jià)值,但是，將蛋白酶用于商業(yè)用途通常需要它們?cè)诜巧項(xiàng)l件下(例如高溫和pH值，強(qiáng)鈣螯合劑和去污劑)保持高活力.在蛋白酶的自然進(jìn)化過(guò)程中，沒(méi)有選擇壓力意味著大多數(shù)蛋白酶在這些非生理?xiàng)l件下是不穩(wěn)定或無(wú)活力的.通過(guò)定點(diǎn)誘變或定向進(jìn)化進(jìn)行的蛋白酶工程改造可以產(chǎn)生具有改進(jìn)功能的蛋白酶，以滿(mǎn)足商業(yè)應(yīng)用的需求[23].另外，科技的發(fā)展使得我們可以利用更有效的手段，如納米技術(shù)應(yīng)用于酶的生產(chǎn)和表征.諸如金屬氧化物納米顆粒、聚合物納米顆粒、金屬納米顆粒和磁性納米顆粒等具有優(yōu)異性能的基本載體材料可用作酶的保護(hù)劑[24].由于納米顆粒具有較高的表面積和較強(qiáng)的吸附力，因此可以作為固定酶的基質(zhì).固定化總體上改善了酶的穩(wěn)定性，還保護(hù)了酶分子不被展開(kāi).使用固定化酶的另一個(gè)非常重要的標(biāo)準(zhǔn)是，酶分子表現(xiàn)為游離酶，并且在水環(huán)境中暴露出布朗運(yùn)動(dòng)，避免了酶生物分子的聚集，從而豐富了酶的活力.