硼酸對(duì)霞多麗葡萄葉片抗氧化酶類(lèi)的影響

楊述睿

（甘肅民勤連古城國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管護(hù)中心，甘肅 民勤 733300）

霞多麗是一個(gè)古老的優(yōu)良白葡萄酒品種，果實(shí)品質(zhì)好，栽培經(jīng)濟(jì)效益顯著，發(fā)展前景十分廣闊。隨著生活水平的提高，人們對(duì)霞多麗葡萄果品的安全性和營(yíng)養(yǎng)性有了更高的要求［1］。

硼是植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中必需的微量元素，對(duì)維持細(xì)胞生命活動(dòng)及穩(wěn)定細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)具有重要作用。硼還會(huì)影響植物細(xì)胞內(nèi)一些物質(zhì)的活性，從而影響細(xì)胞膜的透性及細(xì)胞內(nèi)其他物質(zhì)的代謝［2］。據(jù)報(bào)道，在缺硼條件下，甘藍(lán)型油菜葉片中的過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）活性呈下降趨勢(shì)，而過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）活性呈上升趨勢(shì)［3-4］；硼酸能提高紅掌葉片中SOD、POD活性，且二者的變化規(guī)律相似［5］。而對(duì)于早期缺硼的葡萄，其新梢頂端的幼葉會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)散的黃色或失綠斑點(diǎn)，隨后斑點(diǎn)連成一片，最后變成褐色枯死；嚴(yán)重時(shí)，其花冠不能正常開(kāi)裂，后變成赤褐色，最終脫落；其花粉的發(fā)芽率顯著低于健康植株，還會(huì)影響受精，引起落花；落花后大約7 d，其子房多數(shù)脫落，坐果率較低［6］。葡萄花而不實(shí)，口感變差，產(chǎn)量降低，這些均為缺硼所致［7］。

與此同時(shí)，過(guò)量的活性氧可引起植物細(xì)胞程序性死亡，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使植物衰老和死亡。提高SOD、POD、CAT活性，能使細(xì)胞內(nèi)的活性酶維持在一個(gè)較低水平，保護(hù)植物體免受自由基傷害。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

試驗(yàn)選用四年生霞多麗釀酒葡萄，種植株行距為0.7 m×2.0 m。試驗(yàn)試劑選用硼酸、氮藍(lán)四唑、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、Triton X-100核黃素、雙氧水、石英砂、L-甲硫氨酸、抗壞血酸及聚乙烯吡咯烷酮。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 硼酸噴施方法。分別設(shè)置0‰（CK）、1‰、2‰、3‰和4‰5個(gè)濃度的硼酸水溶液處理，間隔15 d，重復(fù)進(jìn)行4次施肥處理。每次將不同濃度的硼酸溶液分別均勻噴至試驗(yàn)組葉片的正反兩面，以葉面出現(xiàn)水珠但不滴流為止。每個(gè)處理重復(fù)3次，3株為1個(gè)小區(qū)，共45株，掛牌采樣。

1.2.2 采樣方法。采樣時(shí)間為葡萄坐果期、轉(zhuǎn)色期及成熟期。每次采集時(shí)，選擇葡萄植株距地面高0.8～1.2 m的葉片，盡量保證所采葉片的顏色與葉面積一致。將采摘好的葉片放置于冰盒中冷藏，并用蒸餾水洗滌3次，之后用濾紙擦干葉面水分，完全晾干后用小剪刀快速剪碎，混勻、稱(chēng)量、分樣包裝，放置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 粗酶液提取。取處理好的樣品0.5 g，加提取液2 mL及適量石英砂于研缽中研磨，用提取液定容至10 mL刻度試管中，冰浴10 min，期間多次搖晃，使提取液與樣品充分接觸。將冰浴后的粗酶液裝入離心管中，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速在4℃溫度條件下離心20 min，取上清液置于4℃環(huán)境保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 CAT活性測(cè)定。在比色皿中加入制備好的粗酶液0.2 mL、0.033 5 mol/L的雙氧水2.8 mL，測(cè)定2 min內(nèi)OD240吸光度值，以蒸餾水作為對(duì)照［8］。CAT活性計(jì)算方法見(jiàn)公式（1）：

式（1）中，ΔA240表示反應(yīng)混合液的吸光度變化值（A始－A終，A始表示光下對(duì)照管吸光度，A終表示樣品測(cè)定管吸光度），Vt表示測(cè)定時(shí)酶液的體積（0.2 mL），Vs表示酶提取液總體積（10.0 mL），t表示加雙氧水開(kāi)始到最后一次讀數(shù)的時(shí)間（min），F(xiàn)W表示樣品鮮質(zhì)量（g）。

1.3.3 POD活性測(cè)定。按順序向比色皿中分別加入粗酶液0.2 mL、0.3%愈創(chuàng)木酚2.6 mL、0.6%H2O20.2 mL，構(gòu)成總體積為3 mL的反應(yīng)體系，用蒸餾水調(diào)零。加入H2O2后立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，測(cè)定2 min內(nèi)OD470吸光度值。POD活性計(jì)算方法見(jiàn)公式（2）：

式（2）中，OD470F表示反應(yīng)混合液吸光度終止值，OD470I表示反應(yīng)混合液吸光度初始值，V1表示樣品提取液總體積（mL），F(xiàn)W表示樣品鮮質(zhì)量（g），t表示試樣反應(yīng)時(shí)間（min），V2表示測(cè)定用粗酶液量（mL）。

1.3.3.4 SOD活性測(cè)定。在遮光條件下，向試管中依次加入0.05 mol/L pH值為7.8的PBS溶液1.5 mL、130 mmol Met溶液0.3 mL、750μmol/L NBT溶液0.3 mL、100μmol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液0.3 mL、蒸餾水0.5 mL。向1號(hào)管加入粗酶液0.1 mL，2、3號(hào)管分別加入等量蒸餾水，再加入20μmol/L核黃素0.3 mL。加液完成后立即將3號(hào)管置于黑暗環(huán)境下，1、2號(hào)管置于3 000～4 000 lx、25℃光照環(huán)境下，待2號(hào)管變色后立即遮光，3號(hào)管液體做對(duì)照，測(cè)定SOD在OD560下的吸光度值。SOD活性計(jì)算方法見(jiàn)公式（3）：

式（3）中，A0表示光下對(duì)照管吸光度值，AS表示樣品測(cè)定吸光度值，Vt表示樣品提取液總體積（mL），F(xiàn)W表示樣品鮮質(zhì)量（g），Vs表示測(cè)定用粗酶液量（mL），t表示顯色反應(yīng)光照時(shí)間（min）。

2 結(jié)果與分析

隨著硼酸溶液濃度的增加，霞多麗葡萄葉片的SOD活性表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，硼酸水溶液處理后的葉片SOD活性均高于CK，分別高出1.11、1.17、1.22、1.18倍，其中3‰硼酸處理與CK的SOD活性存在顯著性差異（P＜0.05），其值為20 793.87 U/（gFW·h）（見(jiàn)圖1）。

圖1 不同濃度硼酸對(duì)霞多麗葉片SOD活性的影響

隨著硼酸溶液濃度的增加，霞多麗葡萄葉片POD活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，硼酸水溶液處理后的葉片POD活性均高于CK，分別高出1.02、1.04、1.05、1.04倍，其中3‰硼酸處理與CK的POD活性存在顯著性差異（P＜0.05），其值為348.82μg/（gFW·min）（見(jiàn)圖2）。

圖2 不同濃度硼酸對(duì)霞多麗葉片POD活性的影響

隨著硼酸溶液濃度的增加，霞多麗葡萄葉片CAT活性呈先上升后下降的趨勢(shì)，硼酸水溶液處理后的葉片CAT活性均高于CK，分別高出1.37、1.34、1.83、1.35倍，其中3‰硼酸處理與CK的CAT活性存在顯著性差異（P＜0.05），其值為729.13 U/（gFW·min）（見(jiàn)圖3）。

圖3 不同濃度硼酸對(duì)霞多麗葉片CAT活性的影響

3 結(jié)論

與對(duì)照（CK）相比，硼酸水溶液處理對(duì)霞多麗葡萄葉片的SOD、POD、CAT活性及細(xì)胞膜完整率均有提升作用，具體表現(xiàn)為3‰硼酸溶液處理霞多麗葡萄葉片的SOD、POD、CAT活性較CK分別提升了1.22、1.05、1.83倍，且均存在顯著性差異（P＜0.05）。

過(guò)量的活性氧能引起植物細(xì)胞程序性死亡，嚴(yán)重時(shí)會(huì)使植物衰老和死亡；低濃度的活性氧能作為信號(hào)分子，誘導(dǎo)防御基因的表達(dá)和植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)反應(yīng)，調(diào)控不同的代謝反應(yīng)［9-10］。SOD活性具有控制膜質(zhì)過(guò)氧化水平、保護(hù)酶系統(tǒng)的作用，能抑制自由基對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的危害。POD是植物體內(nèi)自由基清除酶之一，能使植物體內(nèi)活性氧維持在較低水平，保護(hù)細(xì)胞免受傷害［11］。提高SOD、POD、CAT活性，可使細(xì)胞內(nèi)的活性酶維持在一個(gè)較低水平，保護(hù)植物體免受自由基傷害［12-13］。該文通過(guò)選取上述3種酶為考察指標(biāo)，間接分析硼對(duì)釀酒葡萄霞多麗樹(shù)體壽命的影響，結(jié)果表明，一定濃度的硼肥能有效提高釀酒葡萄霞多麗樹(shù)體的抗氧化能力，并延長(zhǎng)釀酒葡萄霞多麗樹(shù)體的壽命。