液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中林可霉素殘留量的不確定度評(píng)定

◎ 石雪芬，范明志，蔣 龍，石美蓮，陳金余

（深圳信測(cè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司，廣東 深圳 518000）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

前處理使用的試劑甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉和氯化鈉為AR級(jí)別；流動(dòng)相使用的試劑乙腈、甲酸銨均為質(zhì)譜純；林可霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度93.9%，純度偏差±1.0%，生產(chǎn)廠家為中國(guó)食品藥品檢定研究院。

15%乙腈水溶液：150 mL甲醇與850 mL水混合；甲酸銨溶液：0.1 mmol·L-1。0.63 g甲酸銨加水溶解至1 000 mL；2%氯化鈉溶液：稱取10.0 g氯化鈉，溶解于500 mL水中；磷酸鹽緩沖溶液：0.1 mol·L-1。6.0 g磷酸氫二鈉溶解于450 mL水中，用氫氧化鈉飽和溶液調(diào)節(jié)pH=8，用水定容至500 mL，使用前配制；甲醇+水溶液（2+3）：400 mL甲醇與600 mL水混合，使用前配制。

1.2 儀器與設(shè)備

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Triple Quad 4500；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：北京恒奧德HAD-XZF2；萬分之一電子天平：上海精其FA2204N；水浴氮吹儀器：北京恒奧德H30102；多管渦旋混旋儀：上海精其LF-200 ；臺(tái)式離心機(jī)：凱特TD5；固相萃取裝置：北京恒奧德H27666

1.3 方法

按GB/T 20762—2006采用液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測(cè)定雞肉中林可霉素殘留量。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)過程各不確定度來源分析、計(jì)算和合成，從而評(píng)定其不確定度。

稱取5 g試樣，置于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，于振蕩器上劇烈振蕩20 min，再加入2.0 g無水硫酸鈉、1 g氯化鈉和3.0 mL正己烷，于振蕩器上劇烈振蕩10 min。以3 500 r·Lmin-1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取乙腈于雞心瓶中，于55 ℃水浴中旋蒸至近干左右，待凈化。

用7 mL磷酸鹽緩沖溶液分兩次溶解殘液，使樣液以小于1.0 mL·min-1的流速通過Oasis HLB固相萃取柱。樣液全部流出后，再用10 mL水和5 mL甲醇十水溶液洗柱，棄去全部流出液，固相萃取柱用真空泵抽干1 h。再用10 mL甲醇洗脫于15 mL錐形試管中，用氮?dú)鉂饪s儀于55 ℃水浴中吹至近干，準(zhǔn)確加入

1.0 mL 15%乙腈水溶液溶解殘?jiān)?。過0.2 μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

2 數(shù)學(xué)模型分量的來源及分析

雞肉中林可霉素殘留量定量檢測(cè)計(jì)算公式為：

式中：X-樣品中9種大環(huán)內(nèi)酯類的含量，mg·kg-1；C-根據(jù)工作曲線計(jì)算的樣品溶液的濃度，μg·mL-1；V-定容體積，mL；m-樣品質(zhì)量，g；1 000-單位換算。由上述公式可見，根據(jù)不確定度的傳播定律，可得到被測(cè)樣品中被測(cè)物含量X的不確定度u(p)計(jì)算公式（2），9種大環(huán)內(nèi)酯類不確定度的因果關(guān)系魚骨圖分析如圖1所示[1]。

式中：u(p)-林可霉素濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(Cstd)-林可霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(m)-樣品稱量天平和稱量重復(fù)性的不確定度；u(Vsample)-樣品提取定容引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度；u(A)-重復(fù)測(cè)定樣品引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

3 林可霉素的不確定度分量計(jì)算

3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的不確定度

3.1.1 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度產(chǎn)生的相對(duì)不確定度

林可霉素93.9%，純度偏差±1.0%，生產(chǎn)廠家，中國(guó)食品藥品檢定研究院。按供應(yīng)商目錄所給純度，假定均勻分布，林可霉素相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.1.2 稱量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度稱量引入的不確定度來自兩個(gè)方面。

（1）稱量變動(dòng)性，在50 g以內(nèi)，變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08 mg。

（2）用十萬分之一天平稱取10 mg標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于10.00 mL容量瓶中，用乙腈-水（3∶7體積比）溶液定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液為1 mg·mL-1。天平的校準(zhǔn)證書給出在95%置信水平時(shí)，不確定度為0.3 mg，按照正態(tài)分布考慮評(píng)定其標(biāo)準(zhǔn)不確定度。查表得，當(dāng)置信水平p＝95%時(shí)，k＝1.96。林可霉素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為上述兩項(xiàng)合成得出稱量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

3.1.3 配制儲(chǔ)備液時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

使用10.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，其不確定度包括3個(gè)部分。

（1）由于玻璃的膨脹系數(shù)很小，因溫度引起的體積變化此處可以忽略不計(jì)。

（2）容量瓶體積的不確定度，按《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器 單標(biāo)線容量瓶》（GB/T 12806—2011）規(guī)定，A級(jí)單標(biāo)線10.00 mL容量瓶的容量允許差為±0.02 mL，按均勻分布，用容量瓶配置標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為：

（3）充滿液體至容量瓶刻度的估讀誤差，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)得估讀誤差為0.05 mL，分布考慮矩形分布，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：則用10.00 mL容量瓶配制1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.1.4 稀釋工作液時(shí)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。先用1 mL的吸量管移取1 mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至100.00 mL容量瓶中，定容至刻度。用1.00 mL的吸量管移取0.10 mL的100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液至100.00 mL容量瓶中，定容至刻度。其不確定度包括2次100.00 mL容量瓶和2次1.00 mL移液管的相對(duì)不確定度。

（1）1 mL移液管容量允差參照《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器 分度吸量管》（GB 12807—1991）規(guī)定：1.00 mL標(biāo)稱容量的允許差為±0.008 mL，按均勻分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差為[3]：

（2）由于玻璃的膨脹系數(shù)很小，因溫度引起的體積變化此處可以忽略不計(jì)。

（3）100.00 mL容量瓶允差參照《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器 單標(biāo)線容量瓶》（GB 12806—2011）規(guī)定，100.00 mL標(biāo)稱容量的允許差為±0.1 mL，按均勻分布，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（4）充滿液體至容量瓶刻度的估讀誤差，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)得估讀誤差為0.05 mL，考慮矩形分布，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則用100.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋至10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液，10 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋至100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為：

綜上所述，配制林可霉素準(zhǔn)儲(chǔ)備液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2 樣品稱量的不確定度

稱量雞肉樣品的質(zhì)量為5.001 7 g，稱量不確定度來自兩個(gè)方面[4]。

（1）稱量變動(dòng)性，在50 g以內(nèi)，變動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.08 mg。

（2）天平校正產(chǎn)生的不確定度，準(zhǔn)證書給出的在95%置信概率時(shí)為0.3 mg，按照正態(tài)分布考慮評(píng)定其標(biāo)準(zhǔn)不確定度。查表得，當(dāng)置信水平p＝95%時(shí)，k＝1.96，換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.3/1.96＝0.153 1 mg。

由上述兩項(xiàng)合成得出稱量的標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

3.3 樣品定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品定容至1.0 mL容量瓶中，其不確定度包括3個(gè)部分。

（1）由于玻璃的膨脹系數(shù)很小，因溫度引起的體積變化可以忽略不計(jì)。

（2）容量瓶體積的不確定度，按《實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器 單標(biāo)線容量瓶》（GB/T 12806—2011）規(guī)定，A級(jí)單標(biāo)線2 mL容量瓶的容量允許差為±0.01 mL，按均勻分布，用容量瓶配置標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度均為：

（3）充滿液體至容量瓶刻度的估讀誤差，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)得估讀誤差為0.01 mL，考慮矩形分布，其引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

則用10.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液[5]的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.4 重復(fù)測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(A)

重復(fù)測(cè)定6次，結(jié)果見表1，假定均勻分布，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 重復(fù)測(cè)定6次的數(shù)據(jù)結(jié)果表

4 林可霉素的合成不確定度

林可霉素的合成不確定度為：

5 林可霉素的擴(kuò)展不確定度

取包含因子k=2，置信水平約為95%，則擴(kuò)展不確定度為：

6 結(jié)果報(bào)告

從測(cè)量評(píng)定分析結(jié)果可看出，本方法不確定度分量最大的是樣品重復(fù)測(cè)定引入的不確定度，其次是標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度和樣品重復(fù)性引入的不確定度。當(dāng)林可霉素殘留量為2.71 μg·kg-1時(shí)，測(cè)定結(jié)果表示為（2.71±0.084）μg·kg-1，k=2。