重樓皂苷Ⅶ抑制Wnt/β-catenin信號減少白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥介質(zhì)分泌

李真 李婕 黃賢明 孟凡力

(青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院) 1藥劑科，山東 青島 266011；2血管外科；3內(nèi)分泌科)

骨關(guān)節(jié)炎常見于60歲以上老年人，其治療以減輕疼痛、恢復(fù)和重建關(guān)節(jié)功能為主，骨關(guān)節(jié)的發(fā)生涉及炎癥、細(xì)胞因子、軟骨細(xì)胞凋亡等一系列復(fù)雜過程〔1〕。白細(xì)胞介素(IL)-1β是誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要因子，可進(jìn)一步加重細(xì)胞炎癥損傷，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，造成骨關(guān)節(jié)破壞〔2〕。重樓皂苷Ⅶ是一種重樓的活性成分，有抗腫瘤、消炎、抗骨質(zhì)疏松等作用〔3〕。重樓皂苷Ⅶ具有抗骨關(guān)節(jié)炎的作用，其治療后的骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型關(guān)節(jié)炎病理損傷明顯改善，炎癥因子水平降低〔4〕?，F(xiàn)階段尚不清楚重樓皂苷Ⅶ對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞作用。本研究旨在探討重樓皂苷Ⅶ對IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥介質(zhì)釋放的影響和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞(武漢普諾賽生命科技有限公司，編號：CP-H096)，人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液中，細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2培養(yǎng)箱。藥物：重樓皂苷Ⅶ(四川省維克奇生物科技有限公司，規(guī)格：20 mg，編號：wkq-00731，純度：≥ 98%)。試劑與儀器：腫瘤壞死因子(TNF)-α含量檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；兔抗c-myc抗體購自美國Abcam；IL-8含量檢測試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)抗體購自美國Abcam；一氧化氮(NO)含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗β-連環(huán)蛋白(catenin)抗體購自美國Cell Signaling Technology；Wnt/β-catenin信號激活劑LiCl購自美國Sigma；兔抗剪切的含半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(酶切Caspase)-3抗體購自美國Abcam；IL-6含量檢測試劑盒購自杭州康知生物科技有限公司；流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特；SpectraMax iD5型酶標(biāo)儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.2分組和給藥方法 根據(jù)處理方法不同，將關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分成對照組、IL-1β組、重樓皂苷Ⅶ低劑量組、重樓皂苷Ⅶ中劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組。取對數(shù)期的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求，分別接種到不同的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞接種密度為5×104個(gè)/ml，細(xì)胞貼壁后，分別按照對照組、IL-1β組、重樓皂苷Ⅶ低劑量組、重樓皂苷Ⅶ中劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組分組方法處理，IL-1β組加入終濃度為10 ng/ml IL-1β〔2〕，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組細(xì)胞培養(yǎng)液中同時(shí)分別添加終濃度為0.1、0.2、0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組細(xì)胞培養(yǎng)液中添加終濃度為0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ和20 mmol/L Wnt/β-catenin信號激活劑LiCl〔5〕。對照組以常規(guī)方法培養(yǎng)。

1.3CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種到96孔板內(nèi)，按照1.2中方法處理或給予0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在每個(gè)孔內(nèi)添加CCK-8溶液10 μl，放在37℃環(huán)境孵育4 h。用酶標(biāo)儀測定490 nm的OD值，以對照組細(xì)胞存活率為100%，分析其余各組細(xì)胞存活率變化。

1.4Western印跡方法檢測蛋白表達(dá) 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種到12孔板內(nèi)，按照1.2中方法處理，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，添加細(xì)胞裂解試劑提取細(xì)胞總蛋白，將蛋白樣品與2倍上樣緩沖液混合煮沸5 min。根據(jù)蛋白分子量大小配制分離膠和濃縮膠，每個(gè)上樣孔內(nèi)添加40 μg，在濃縮膠中使用100 V電壓電泳，在分離膠中使用120 V的電壓電泳。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜電壓設(shè)置為90 V，轉(zhuǎn)膜90 min。將聚偏氟乙烯(PVDF)膜放在5%脫脂奶粉中，室溫結(jié)合2 h，然后把PVDF膜放在一抗溶液(酶切Caspase-3一抗按照1∶600稀釋，β-catenin、c-myc、iNOS一抗按照1∶1 000稀釋)中，4℃結(jié)合過夜，PVDF膜放在二抗溶液(二抗按照1∶4 000稀釋)中，室溫結(jié)合2 h。電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，TANON GIS 軟件分析條帶的灰度值，GAPDH作為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)變化。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種到12孔板內(nèi)，按照1.2方法處理，細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷后的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后將細(xì)胞懸浮在300 μl結(jié)合緩沖液中，依次添加5 μl Annexin V-FITC和PI溶液，分別在室溫中避光反應(yīng)20 min，在用流式細(xì)胞儀檢測前再添加200 μl結(jié)合緩沖液。

1.6微量法檢測NO含量 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種到12孔板內(nèi)，按照1.2中方法處理，細(xì)胞培養(yǎng)24 h以后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，用NO含量檢測試劑盒測定NO含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1重樓皂苷Ⅶ對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖的影響 0.0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率分別為(100.00±10.58)%、(97.96±8.54)%、(96.45±11.26)%、(94.11±12.32)%、(82.02±7.22)%、(63.05±5.17)%。與0.0 μmol/L比較，0.1、0.2、0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率沒有變化，而0.8、1.6 μmol/L重樓皂苷Ⅶ處理后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.05)。選擇對關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖沒有毒性作用的0.1、0.2、0.4 μmol/L重樓皂苷Ⅶ做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2重樓皂苷Ⅶ抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號激活 與對照組比，IL-1β組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；見圖1和表1。

1～6：對照組、IL-1β組、重樓皂苷Ⅶ低劑量組、重樓皂苷Ⅶ中劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量組、重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組；圖3，圖4同圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號相關(guān)蛋白表達(dá)

表1 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)量比較

2.3重樓皂苷Ⅶ調(diào)控Wnt/β-catenin影響IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡 與對照組比，IL-1β組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率逐漸升高，凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率顯著降低，凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)量顯著升高(P<0.05)；見圖2，表2，圖3。

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡情況

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞存活率、凋亡率和酶切Caspase-3蛋白表達(dá)及關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-8含量比較

圖3 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中酶切Caspase-3蛋白表達(dá)

2.4重樓皂苷Ⅶ調(diào)控Wnt/β-catenin影響IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥因子分泌 與對照組比，IL-1β組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-8含量顯著升高(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-8含量逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-8含量顯著升高(P<0.05)；見表2。

2.5重樓皂苷Ⅶ調(diào)控Wnt/β-catenin影響IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中NO分泌 與對照組比，IL-1β組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的NO含量顯著升高，iNOS蛋白表達(dá)量顯著增多(P<0.05)；與IL-1β組比較，重樓皂苷Ⅶ低、中、高劑量組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的NO含量逐漸降低，iNOS蛋白表達(dá)量逐漸減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與重樓皂苷Ⅶ高劑量組比較，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌的NO含量顯著升高，iNOS蛋白表達(dá)量顯著增多(P<0.05)；見圖4和表3。

1～6:對照組，IL-1β組，重樓皂苷Ⅶ低劑量組，重樓皂苷Ⅶ中劑量組，重樓皂苷Ⅶ高劑量組，重樓皂苷Ⅶ高劑量+LiCl組圖4 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中iNOS蛋白表達(dá)

表3 各組關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌NO含量和iNOS蛋白表達(dá)量比較

3 討 論

骨關(guān)節(jié)炎主要累及運(yùn)動關(guān)節(jié)，骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥損傷、過度凋亡是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的重要原因〔6〕。病理?xiàng)l件下，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞受到炎癥因子的作用后，可進(jìn)一步分泌炎癥介質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕。IL-1β是骨關(guān)節(jié)炎損傷的重要誘導(dǎo)因子，可加快關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡，加快骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展〔2,8〕。IL-6、TNF-α、IL-8是骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中的炎癥誘導(dǎo)因子，其表達(dá)上調(diào)促進(jìn)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白酶切Caspase-3表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔9〕。生理狀態(tài)下的NO是細(xì)胞信號傳遞者，與心肺功能、腸胃保護(hù)、血壓調(diào)節(jié)等有關(guān)，而在病理狀態(tài)下，NO可作為炎癥介質(zhì)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生；NO的合成受到一氧化氮合酶的作用，一氧化氮合酶有兩大類，其中iNOS是病理?xiàng)l件下NO合成的主要蛋白酶〔10～12〕。已經(jīng)有研究表明〔13〕，骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中NO合成水平大大增加，iNOS水平升高。本研究說明IL-1β誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷，成功構(gòu)建了體外骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞模型。

重樓皂苷Ⅶ有較高的生物學(xué)活性，能夠調(diào)控免疫力、抑制腫瘤生長、抑制炎癥〔3〕。重樓皂苷Ⅶ對骨關(guān)節(jié)炎也有抑制作用，重樓皂苷Ⅶ降低大鼠骨關(guān)節(jié)炎模型關(guān)節(jié)組織中炎癥因子IL-6、TNF-α含量，減輕病理損傷〔4〕。本研究結(jié)果提示重樓皂苷Ⅶ改善體外骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷，減少炎癥介質(zhì)釋放，抑制細(xì)胞凋亡，與以前的研究結(jié)果一致〔13〕，均說明重樓皂苷Ⅶ可能具有抗骨關(guān)節(jié)的功效。

重樓皂苷Ⅶ發(fā)揮藥理學(xué)作用的機(jī)制復(fù)雜，可調(diào)控信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮作用〔14〕。β-catenin、c-myc分別為Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵因子和下游靶基因，二者表達(dá)改變與Wnt/β-catenin信號激活程度有關(guān)〔15～18〕。Wnt/β-catenin信號在細(xì)胞生長、衰老、炎癥、免疫調(diào)控等方面均有作用，且與腫瘤、動脈粥樣硬化等發(fā)生有關(guān)〔19,20〕。在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展中Wnt/β-catenin信號過度激活，且抑制Wnt/β-catenin信號可改善骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞損傷〔5〕。本研究結(jié)果重樓皂苷Ⅶ通過抑制Wnt/β-catenin信號減少體外骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放，抑制細(xì)胞凋亡，改善細(xì)胞損傷。

綜上，重樓皂苷Ⅶ有抗骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷的作用，可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放，減少細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制與抑制Wnt/β-catenin信號有關(guān)。目前對重樓皂苷Ⅶ調(diào)控Wnt/β-catenin信號的具體機(jī)制還不清楚，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會繼續(xù)研究。