積雪草酸通過調(diào)控PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制A549細(xì)胞的增殖和遷移

王子健 莊作會 劉春霞

(1山東第一醫(yī)科大學(xué)研究生部，山東 濟(jì)南 250118；濟(jì)寧市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 2肺病脾胃病科；3腫瘤科)

肺癌屬于死亡率最高的腫瘤之一〔1〕。且非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占肺癌患者的80%〔2〕。目前，手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射治療及免疫療法是NSCLC的主要治療方法，由于早期NSCLC患者無特異性臨床體征，多數(shù)患者在初診時(shí)已處于中晚期，這導(dǎo)致全球NSCLC患者5年生存率僅為18%〔3,4〕。因此，迫切需要尋找更有效的治療NSCLC的方法。研究表明，中草藥具有廣泛的抗癌作用和低副作用，越來越多的中草藥被單獨(dú)使用或與經(jīng)典的抗癌藥物聯(lián)合作用，從而預(yù)防甚至治療癌癥〔5〕。積雪草酸(AA)是一種天然存在的五環(huán)三萜類化合物，存在于許多植物中，包括積雪草、普氏藻、海棠和桉樹等〔6〕。據(jù)研究，AA可以抑制肝癌和鼻咽癌的惡性進(jìn)展〔7,8〕。機(jī)制上，AA可以通過調(diào)控Smad3/Smad7信號通路在腫瘤中發(fā)揮抑制作用〔9〕。然而AA在NSCLC中的生物學(xué)功能及其作用機(jī)制尚待研究。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/重組人絲氨酸-蘇氨酸激酶(AKT)1/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路與人類腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)〔10,11〕。據(jù)研究，PI3K/AKT/mTOR信號通路參與NSCLC細(xì)胞的生長、增殖和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)進(jìn)程〔12,13〕。然而NSCLC細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR信號通路是否受到AA的調(diào)控尚不清楚。本研究旨在探討AA對NSCLC細(xì)胞增殖和遷移的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 人NSCLC細(xì)胞A549購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒、RIPA蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒和電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)。相關(guān)蛋白的一抗和二抗均購于美國Abcam。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)A549細(xì)胞，含 10% 胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素。并置于37℃，5%CO2的飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每3 d換培養(yǎng)液1次，細(xì)胞對數(shù)期使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。將對數(shù)期的A549細(xì)胞分別用0、10、20、30、40 μg/ml的AA處理，計(jì)為Control組、10 μg/ml組、20 μg/ml組、30 μg/ml組和40 μg/ml組。

1.3CCK-8法測定細(xì)胞活力 將各組A549細(xì)胞以1×105/孔種植于96孔板上。于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)每孔加入10 μl的CCK-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，使用微孔板讀數(shù)儀分別測量細(xì)胞的光密度OD(450 nm)。

1.4BrdU檢測細(xì)胞增殖 將各組A549以按1×105個(gè)/孔接種于24孔板。按說明書加入BrdU標(biāo)記試劑，并將孔板置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞共48 h后，按Sigma公司BrdU抗體操作說明進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色。紅色熒光標(biāo)記增殖的細(xì)胞，藍(lán)色熒光標(biāo)記細(xì)胞總數(shù)，細(xì)胞增殖率=BrdU陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)，取3個(gè)視野細(xì)胞增殖率的平均值為細(xì)胞的增殖率。

1.5細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將各組A549細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以1×106/ml的密度種植于6孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞鋪滿后，用槍頭垂直于培養(yǎng)板劃線。磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，并使用AA(0、10、20 μg/ml)溶液處理，于37℃，5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。于0、24 h取樣、拍照。

1.6Western印跡 RIPA溶液對各組A549細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞總蛋白。用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白質(zhì)樣本的濃度。使用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白提取物分離后轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用5%牛血清白蛋白(BSA)處理膜室溫1 h阻斷非特異性結(jié)合，并與相關(guān)的一抗孵育12 h，然后用二抗室溫孵育1 h。使用ECL顯示蛋白質(zhì)信號，Image J軟件分析蛋白條帶。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1AA對A549細(xì)胞活力的影響 在24、48、72 h隨著AA濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸降低(P<0.05)。見表1。后續(xù)實(shí)驗(yàn)將采用10、 20 μg/ml AA進(jìn)行研究。

表1 CCK-8法檢測AA對A549細(xì)胞活力變化

2.2AA對A549細(xì)胞增殖的作用 與Control組BrdU細(xì)胞陽性率〔(79.73±9.46)%〕相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組〔(57.91±6.92)%、(27.83±4.06)%〕均顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 BrdU檢測A549細(xì)胞的增殖(免疫熒光，×400)

2.3AA對A549細(xì)胞遷移能力的影響 與Control組A549細(xì)胞劃痕的愈合程度〔(72.35±8.42)%〕相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組〔(49.36±7.98)%、(31.04±8.25)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖2 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測A549細(xì)胞的遷移

2.4AA對A549細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響 與Control組相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-14、波形蛋白表達(dá)均顯著降低，見圖3、表2。

表2 Western印跡檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

圖3 Western印跡檢測EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

2.5AA對A549細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號通路的影響 與Control組相比，10 μg/ml組和20 μg/ml組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 Western印跡檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

表3 Western印跡檢測PI3K/AKT/mTOR信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討 論

研究證實(shí)中草藥在多種惡行腫瘤中具有顯著的抗癌作用〔14～16〕。研究報(bào)道AA通過抑制多耐藥基因(MDR)1誘導(dǎo)人肺腺癌A549/DDP細(xì)胞對順鉑(DDP)敏感，并通過PI3K/AKT信號通路抑制(WAVE)3的活化抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和增殖〔17,18〕。AA可以通過破壞線粒體的結(jié)構(gòu)在體外和體內(nèi)抑制肺癌的生長〔19〕。研究表明，AA可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號傳導(dǎo)途徑抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，并誘導(dǎo)其凋亡〔20〕。

EMT是指上皮性質(zhì)的細(xì)胞出現(xiàn)了間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移、侵襲和浸潤〔21〕。VEGF能促進(jìn)血管通透性增加和血管形成等作用；MMP-14與腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲相關(guān)；波形蛋白是中間絲的其中一種蛋白質(zhì)，其與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔22～24〕。本研究結(jié)果表明AA可參與抑制A549細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

PI3K/Akt/mTOR可參與細(xì)胞的生理和病理過程，其被異常激活發(fā)生磷酸化，從而促進(jìn)前列腺癌和乳腺癌惡行進(jìn)展〔25～27〕。研究報(bào)道，乙酰紫草素通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化抑制結(jié)直腸癌生長〔28〕；虎杖苷通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路磷酸化誘導(dǎo)人宮頸癌細(xì)胞凋亡〔29〕。而AA可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路磷酸化在人卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮抑癌作用〔30〕。

本研究表明，AA可抑制A549細(xì)胞的增殖活力；降低細(xì)胞遷移能力;抑制VEGF、MMP-14、和Vimentin蛋白的表達(dá)；進(jìn)一步研究表明AA可抑制p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白的表達(dá)。