基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討酸棗仁湯治療睡眠障礙的作用機制

劉 毅，李 菲，賈躍進，郝世飛

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619； 2.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山西太原030024；3.山西省人民醫(yī)院，山西 太原030012）

睡眠障礙（Sleep disorder）是一種表現(xiàn)為入睡困難、睡眠維持困難或早醒并伴有日間功能障礙的一種睡眠障礙［1］，在人群中發(fā)病率高達 22%~35%［2］。長期失眠會增加罹患認知障礙、心血管疾病、抑郁癥、腫瘤等疾病的風(fēng)險［3-6］，因此存在較大危害。就藥物治療而言，相對于目前西醫(yī)治療睡眠障礙的催眠藥多存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制及依賴性、成癮性等問題［7］，中醫(yī)藥治療疾病則擅于從整體考慮，多成分、多靶點、多途徑地發(fā)揮作用，兼具安全、有效性，因此有一定優(yōu)勢。

中醫(yī)稱“睡眠障礙”為“不寐”，認為其總病機是“營衛(wèi)失和，陰陽不交”［8］，情志不遂所致的不寐較為多見，故治療上多從肝論治?！侗孀C錄·不寐門》載“氣郁既久……則肝血必耗，肝血既耗，則木中之血上不能潤于心，而則不寐”［9］?？梢姼窝юB(yǎng)是不寐的重要證型［1］。酸棗仁湯是治療肝血不足不寐的代表方劑，出自張仲景《金匱要略》，“虛勞虛煩不得眠，酸棗仁湯主之”［10］，臨床試驗證實其對于睡眠障礙有確切的療效［11］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究認為其通過多種靶點、通路發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠、抗抑郁、抗焦慮等作用［12］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)常用來闡釋中藥多成分、多靶點的作用機制，篩選中藥活性成分，是當(dāng)下中藥研究的熱點［13］，但是檢索可得睡眠障礙相關(guān)研究卻較為有限，因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究其作用靶點、通路相關(guān)信息，可以在一定程度上提示睡眠障礙的治療靶點及指導(dǎo)藥物作用機制的相關(guān)研究。

1 方 法

1.1 酸棗仁湯各藥物有效成分搜集與篩選

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），分別以“酸棗仁”“川芎”“知母”“甘草”“茯苓”為關(guān)鍵詞進行檢索，獲得其化學(xué)成分，并將ADME 設(shè)置為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）≥-0.30，得出其有效成分。

1.2 有效成分靶點獲取

將1.1 中所得有效成分逐一在TCMSP 數(shù)據(jù)庫中匹配靶點，在Uniprot 數(shù)據(jù)庫中（https：//www.uniprot.org/）將物種設(shè)置為：智人，并獲取相關(guān)數(shù)據(jù)，利用Excel 將靶點匹配基因名。

1.3 睡眠障礙疾病靶點獲取

借助 GeneCards（https：//www.genecards.org/）、OMIM（https：//omim.org/#）、TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）3 個數(shù)據(jù)庫，以“insomnia disorder”為關(guān)鍵詞進行檢索，得到睡眠障礙相關(guān)疾病靶點，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Excel，合并、去重。

1.4 藥物-疾病基因交集

應(yīng)用R 語言將各藥物成分靶點基因名的并集與疾病靶點基因名的并集取交集，得出酸棗仁湯中有效成分直接對失眠障礙起作用的靶點，并生成Venn 圖。

1.5 疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將酸棗仁湯各有效成分、靶點以及疾病名、方劑名分別作為節(jié)點（node），將其相互作用關(guān)系作為邊（edge），導(dǎo)入到 Cytoscape 3.7.1 軟件，構(gòu)建疾病-方劑-成分-靶點和疾病-方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/）可以對全部可公開獲得的PPI 信息資源進行收集、評分和整合，并通過計算預(yù)測對其補充。將1.4 所得交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫，令物種設(shè)置為智人，去掉沒有關(guān)聯(lián)的節(jié)點，并導(dǎo)出PPI 網(wǎng)絡(luò)圖像和TSV 文件，將TSV 文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1 軟件構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并按照Degree 值篩選核心靶點。

1.7 GO 富集分析以及KEGG 富集分析

將所得交集靶點基因?qū)隡etascape（https：//metascape.org/）分別進行GO 生物過程（Biological Processes，BP）、分子功能 （Molecular Functions，MF）及細胞成分（Cellular Components，CC）富集分析和KEGG 通路富集分析，利用在線作圖平臺微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）、Image GP（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）分別繪制條形圖和氣泡圖，并應(yīng)用R 語言下載其通路圖。

2 結(jié) 果

2.1 酸棗仁湯有效成分和對應(yīng)靶點

通過對TCMSP 進行檢索，并限定OB≥30%、DL≥0.18、BBB≥-0.3，獲得酸棗仁有效成分7 種，對應(yīng)靶點43 個；川芎有效成分6 種，對應(yīng)靶點39個；知母有效成分8 種，對應(yīng)靶點107 個；甘草有效成分69 種，對應(yīng)靶點1270 個；茯苓有效成分6種，對應(yīng)靶點27 個。其中重復(fù)成分2 種，為酸棗仁與甘草的共有成分丁子香萜（MOL000211）及川芎與甘草共有成分谷甾醇（MOL000359），其有效成分基本信息如表1 所示。經(jīng)去重及排除后，酸棗仁湯全方共搜集到有效成分88 種，對應(yīng)靶點82 個，將其匹配Uniprot 數(shù)據(jù)庫，從而獲得基因名。

2.2 睡眠障礙靶點獲取結(jié)果

在 GeneCards 數(shù)據(jù)庫中檢索“insomnia”，得到2281 個靶基因；在OMIM 數(shù)據(jù)庫中檢索“insomnia disorder”并選擇gene map 選項，得到相關(guān)靶點673 個；以“insomnia”為關(guān)鍵詞在 TTD 數(shù)據(jù)庫中檢索，可得28 個靶點。合并以上數(shù)據(jù)刪除重復(fù)值，共計得到失眠障礙相關(guān)靶點基因2916 個。

2.3 藥物-疾病交集結(jié)果

將以上獲取的酸棗仁湯的82 個靶點基因與失眠障礙靶點基因應(yīng)用R 語言取得交集，如圖1，得到36 個交集基因，并將其余基因排除，該36 個基因分屬78 種有效成分。

圖1 酸棗仁湯—睡眠障礙靶基因交集Venn 圖

2.4 睡眠障礙-酸棗仁湯-有效成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

借助Cytoscape 軟件，建立疾病-方劑-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)和疾病-方劑-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，如圖2、圖 3。其中圖 2 共有 116 個節(jié)點，534 條連線，連線表示節(jié)點之間發(fā)生作用，Degree 值大小用節(jié)點面積表示，并按照Degree 值分布。可以看出靶點中Degree 值較大者（Degree>12）有 ESR1、AR、GSK3B、PTGS1、MAPK14、ADRB2、ADRA1B、CHRM1、ACHE。圖3 有177 個節(jié)點，1169 條邊，其中有效成分以MOLID 表示。節(jié)點面積和排列同樣按照Degree 值大小分布，可以看出其中Degree 較大（Degree>22）的有效成分主要有：7-methoxy-2-methyl isoflavone、formononetin、anhydroicaritin、stigmasterol、licochalcone a、shinpterocarpin、2 -［（3R）-8，8 -dimethyl-3，4-dihydro-2H-pyrano［6，5-f］chromen-3-yl］-5-methoxyphenol、vestitol、medicarpin、licoagrocarpin。

圖2 疾病-方劑-成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖3 疾病-方劑-藥物-成分-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.5 蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果

將36 個交集靶點基因?qū)隨tring，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4。圖中節(jié)點表示靶蛋白，連線表示蛋白之間的關(guān)系，總計共有節(jié)點36 個，邊172 條，平均節(jié)點度為9.56。從數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出TSV 文件并導(dǎo)入Cytoscape，然后進行網(wǎng)絡(luò)分析，選擇節(jié)點大小和顏色根據(jù)Degree 值由小到大、由暗到亮分布；同時邊按照Combined score 值大小由細到粗、由暗到亮分布；再選擇Degree 值>12 的核心靶蛋白在中心圓形排列，其余靶蛋白在外周圓形排列，如圖5，其核心靶點分別為 MAOA、AKT1、ACHE、SLC6A4、VEGFA、CAT、MAOB、HTR3A。

圖5 蛋白質(zhì)相互作用核心靶點網(wǎng)絡(luò)

2.6 GO 富集分析和KEGG 富集分析結(jié)果

將36 個交集靶點基因?qū)隡etascape 分別進行 GO 生物過程、GO 分子功能、GO 細胞成分和KEGG 通路富集分析，其中GO 生物過程得到545條富集結(jié)果，GO 分子功能得到61 條富集結(jié)果，GO 細胞成分得到39 條富集結(jié)果，GO 功能富集分析共計得645 條結(jié)果。分別選擇其前20 項、前9 項、前7 項具有代表性的富集項，借助在線繪圖工具制成條形圖，如圖6。將GO 分析的三項合并至同一條形圖，橫軸表示其基因數(shù)目，顏色代表不同的項目。GO 生物過程主要涉及循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、生長調(diào)節(jié)、細胞對有機環(huán)狀化合物的反應(yīng)、化學(xué)突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)等過程；GO分子功能主要與腎上腺素受體活性、類固醇激素受體活性、單胺跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體等功能活性相關(guān)；GO 細胞成分主要包括突觸后膜的組成部分、突觸后特定膜的組成部分、神經(jīng)元投射細胞質(zhì)等。

圖6 GO 富集分析各項條形圖

KEGG 通路富集結(jié)果得出相關(guān)通路61 條，將其中具有代表性的前7 條通路制成富集氣泡圖，如圖7。將通路與交集靶點、酸棗仁湯有效成分三者數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape，制成以三者為節(jié)點，作用關(guān)系為邊的有效成分-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，可以更直觀地將三者聯(lián)系起來，如圖8 所示。其具有代表性的7 條通路分別是神經(jīng)活性配體-受體相互作用、癌癥中的蛋白多糖、酪氨酸代謝、脂肪細胞中的脂肪分解調(diào)節(jié)、FoxO 信號通路、雌激素信號通路、癌癥中的Micro RNA。全部通路中靶點計數(shù)最多者為神經(jīng)活性配體-受體相互作用，提示酸棗仁湯治療睡眠障礙最可能是通過該通路發(fā)揮作用，具體如圖9 所示。

圖7 KEGG 通路富集氣泡圖

圖8 有效成分-通路-靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖9 神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路

3 討 論

近年來，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對睡眠障礙的本質(zhì)、病因?qū)W以及病理生理學(xué)的認識有了很大進展，但是仍然缺乏公認的失眠疾病模型［14］。中醫(yī)學(xué)對于睡眠的認識源遠流長，《黃帝內(nèi)經(jīng)》中對睡眠的形成機制就有記載，“衛(wèi)氣晝?nèi)招杏陉?，夜半則行于陰，陰者主夜，夜者主臥……陽氣盡，陰氣盛則目瞑，陰氣盡而陽氣盛，則寤矣”［15］。即睡眠是一個依賴營衛(wèi)之氣推動的節(jié)律周期，而這個周期一旦被破壞就會造成失眠。《諸病源候論》云“陰氣虛，衛(wèi)氣獨行于陽，不入于陰，故不得眠”［16］，說明睡眠障礙的發(fā)生主要由于營衛(wèi)之氣運行失常，睡眠節(jié)律發(fā)生改變所致。而肝臟是與營衛(wèi)之氣運行相關(guān)性較大的臟腑，其生理功能主要包括主疏泄和藏血，營衛(wèi)的正常運行有賴于肝的疏泄功能推動，也受制于肝對血的調(diào)控［17］，《素問·五臟生成篇》曰“人臥血歸于肝”［15］。

酸棗仁湯常用以治療肝血不足所致的虛煩不寐，方含酸棗仁、川芎、知母、甘草、茯苓5 味中藥，酸棗仁主要功效是補肝養(yǎng)心、安神斂汗，藥理學(xué)研究證實其有GABA 激動劑作用從而表現(xiàn)抗焦慮、鎮(zhèn)靜的功能［18］；甘草有補脾益氣、調(diào)和諸藥的功效，有研究報道其有神經(jīng)保護的作用［5，19］；川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛，相關(guān)研究顯示該藥物具有腦保護的作用［20］；知母清熱瀉火、生津潤燥，研究確認其存在神經(jīng)保護的功效［21］；茯苓可利水滲濕、健脾安神，并存在抗炎、鎮(zhèn)靜催眠作用［22］。即酸棗仁湯中的藥物存在鎮(zhèn)靜、催眠或神經(jīng)保護等多種可能有益于治療睡眠障礙的作用。

本研究得出酸棗仁湯有效成分88 種，相應(yīng)潛在靶點有82 個，與睡眠障礙交集靶點36 個，核心靶點 8 個，GO 富集結(jié)果 645 條，KEGG 通路 61條。值得注意的是，藥物-疾病交集靶點有36 個，而卻分屬78 種成分，因此可以得出各藥物成分之間可能通過協(xié)同作用多靶點、多通路發(fā)揮治療作用。由圖4 得出核心靶點分別為MAOA、AKT1、ACHE、SLC6A4、VEGFA、CAT、MAOB、HTR3A，可認為其為酸棗仁湯治療睡眠障礙的核心靶點。MAOA 編碼一種氧化還原酶，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍組織神經(jīng)活性代謝中起到重要作用［16］，研究顯示MAOA 啟動子等位基因活性較低的個體可能會出現(xiàn)抑郁癥狀和睡眠不足的風(fēng)險增加［23］。Kalonia H 等［24］研究得出氧化損傷與睡眠剝奪后的記憶缺陷有關(guān)，MAOB 和 MAOA 功能基本一致［25］。AKT1 編碼一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可控制成人神經(jīng)發(fā)生過程中新生神經(jīng)元整合過程的速度，包括正確的神經(jīng)元定位、樹突發(fā)育和突觸形成［26］。乙酰膽堿酯酶（Ache）通過釋放到突觸間隙快速水解乙酰膽堿，以終止神經(jīng)肌肉接頭處的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并在神經(jīng)元凋亡中發(fā)揮作用［27］，研究證實人類應(yīng)用乙酰膽堿酯酶抑制劑可明顯減少REM 睡眠潛伏期并增加 REM 睡眠密度［28］。SLC6A4 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能主要是5-羥色胺（5-HT）信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)［29］，HTR3A 基因編碼 5-HT 3 型受體的亞基 A，5-HT 有神經(jīng)遞質(zhì)、激素和促分裂原等作用［30］。Teegarden BR 等［31］研究認為血清素通過 5-HT 受體在調(diào)節(jié)睡眠結(jié)構(gòu)中起著積極的作用；Pandhare A等［32］研究顯示抗抑郁藥安非他酮對5-羥色胺3A 型受體具有變構(gòu)阻滯作用，并可能通過此過程發(fā)揮藥效。由以上可以看出，酸棗仁湯的核心靶點幾乎都作用于神經(jīng)系統(tǒng)，并且都直接或間接對睡眠有影響。

GO 富集結(jié)果顯示酸棗仁湯主要的生物過程為：循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、化學(xué)突觸傳遞、神經(jīng)遞質(zhì)水平調(diào)節(jié)等，其中循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程可從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的角度在一定程度上闡釋酸棗仁湯治療肝血不足的機理，文獻研究表明酸棗仁湯對睡眠和血液系統(tǒng)存在協(xié)同影響［33］。其他的GO 富集結(jié)果與睡眠障礙的神經(jīng)遞質(zhì)機制吻合，故不贅述。KEGG 通路富集顯示通路中靶基因占比最高者為神經(jīng)活性配體-受體相互作用，目前認為調(diào)節(jié)睡眠覺醒的分子因素主要包括促覺醒化學(xué)物質(zhì)，如食欲素、去甲腎上腺素、組胺以及促睡眠化學(xué)物質(zhì)，如γ-氨基丁酸（GABA）、腺苷、褪黑激素和前列腺素D2 都是通過該通路發(fā)揮作用［34］。另外需要提到的是雌激素信號通路，流行病學(xué)顯示，睡眠障礙在女性中更普遍而且更年期女性有較高的發(fā)病率［35-36］。研究證實雌激素和孕酮可影響女性睡眠方式，且與特定時期的睡眠障礙和嗜睡癥相關(guān)［37］。同時ESR1 是有效成分-通路-靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)中重要的靶點。綜合來看網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)論基本符合現(xiàn)代藥理學(xué)與臨床研究結(jié)果。

綜上所述，從對酸棗仁湯有效成分、相關(guān)靶點、通路的相互關(guān)系研究得出酸棗仁湯治療睡眠障礙可能主要通過調(diào)節(jié)神經(jīng)受體-配體相互作用、循環(huán)系統(tǒng)相關(guān)反應(yīng)、機體營養(yǎng)代謝以及雌激素相關(guān)作用來發(fā)揮作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)局限于理論研究，但可為后續(xù)進一步研究提供思路。