山藥 DoARID4基因克隆與表達(dá)特異性分析

王 琪，岳寧波，黃 鑫，閆見敏，李云洲

(貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

山藥(DioscoreaoppositifoliaL.)屬于薯蕷科(Dioscoreaceae)薯蕷屬(Dioscorea)草質(zhì)藤本植物，其塊莖富含淀粉，可供蔬食，是中國(guó)重要的園藝蔬菜，此外山藥含有豐富的多糖、氨基酸、皂苷、膽堿等成分[1]，還有減緩衰老和預(yù)防癌癥等多種疾病的保健功能，因此具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

山藥種植過(guò)程中經(jīng)常發(fā)現(xiàn)畸形山藥的產(chǎn)生，而畸形山藥產(chǎn)生主要由于生長(zhǎng)過(guò)程中遇到障礙物或由于物理原因造成傷口，而造成山藥繼續(xù)生長(zhǎng)而產(chǎn)生畸形組織。除了外部環(huán)境是造成山藥畸形的原因，另外，遺傳因素也是山藥畸形的主要原因，已有研究表明植物扁莖形成的主要原因是頂端分生組織異常，頂端分生組織的激增改變了器官原基的排列方式，并造成畸形形成[2-3]。富含AT互作結(jié)構(gòu)域蛋白(The AT-rich interaction domain，ARID)在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用，目前已有研究表明，OsARID3調(diào)控水稻頂端分生組織的形成發(fā)育[4]。因此，探究ARID蛋白的功能，有望為畸形山藥形成機(jī)制提供理論依據(jù)。

富含AT互作結(jié)構(gòu)域蛋白(ARID)家族是一類廣泛存在于真核生物中的DNA綁定蛋白[5-6]，前人對(duì)酵母、果蠅和哺乳動(dòng)物的研究[7-9]表明ARID蛋白在許多生物過(guò)程起著至關(guān)重要的作用，包括胚胎發(fā)育和細(xì)胞周期調(diào)控[10]。關(guān)于植物ARID蛋白功能的研究非常有限。擬南芥中研究發(fā)現(xiàn)ARID1[11]和含有ARID-HMG雙DNA結(jié)合域蛋白AtHMGB15[12]在精細(xì)胞形成和花粉管生長(zhǎng)發(fā)揮重要作用。Hansen等[13]在擬南芥中鑒定出ARID-HMG1和ARID-HMG2，但其功能仍然未知。Zhu等[14]研究表明，ARID蛋白對(duì)于蓮藕的藕節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育來(lái)說(shuō)是必須。Xu等[4]研究表明OsARID3對(duì)于水稻莖尖分生組織發(fā)育是必須的。目前，關(guān)于山藥ARID蛋白的序列和功能仍未見報(bào)道，因此，本試驗(yàn)以‘鐵棍山藥’為材料，依據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的擬南芥AtARID1(AT2G46040.1)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，克隆出一條長(zhǎng)731 bp的條帶，將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該基因與芋頭、蓮藕的ARID4序列相似性相對(duì)較高，因此將其命名為DoARID4，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并利用q-PCR分析了DoARID4在山藥不同組織中的表達(dá)特異性，為深入探究DoARID4在山藥生長(zhǎng)發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山藥材料來(lái)自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院植物病理教研室，山藥零余子經(jīng)1.0% NaClO消毒后，用無(wú)菌水沖洗殘留的NaClO，播種在滅菌的土壤中，營(yíng)養(yǎng)缽育苗，置于人工智能光照培養(yǎng)箱(中國(guó)寧波東南儀器公司)進(jìn)行培養(yǎng)：光照強(qiáng)度240 mol·m-2·s-1，光/暗：16 h/8 h，溫度28 ℃/18 ℃(光/暗)，相對(duì)濕度70%。

1.2 RNA的提取

采用RNA提取試劑盒(RNA isolater Total RNA Extraction Reagent)提取植株總RNA，購(gòu)買于南京諾維贊生物科技有限公司。提取山藥莖、山藥豆播種后5～6片葉片、10～12片時(shí)期的葉片總RNA，經(jīng)過(guò)DNAase去除DNA后，經(jīng) 1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，NanoDrop One微量核酸濃度檢測(cè)儀[賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司]檢測(cè)其濃度。檢測(cè)合格后的RNA用于反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(HiScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit，購(gòu)買于南京諾維贊生物科技有限公司)按照說(shuō)明書操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA，凍存于-80 ℃保存,備用。

1.3 DoARID4基因的克隆

根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的AtARID1(AT2G46040.1)基因序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物DoARID4-F和DoARID4-R，以‘鐵棍山藥’反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，克隆DoARID4基因序列，使用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：2 μL cDNA+1.5 μL F引物+1.5 μL R引物+15 μLTaqDNA Mix，ddH2O補(bǔ)齊到30.0 μL；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。PCR產(chǎn)物送往北京諾賽基因組研究中心有限公司測(cè)序。DoARID4序列擴(kuò)增所用引物見表1。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 研究所用的PCR引物

1.4 DoARID4生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，DoARID4蛋白的理化性質(zhì)分析通過(guò)Protparam網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行，PSIPRED網(wǎng)站網(wǎng)站(https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)DoARID4蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，Softberry-Protcomp網(wǎng)站(http://www.softberry.com/)預(yù)測(cè)DoARID4蛋白亞細(xì)胞定位，TMHMM網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測(cè)DoARID4蛋白跨膜區(qū)，NetPhos 3.1網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測(cè)DoARID4蛋白磷酸化位點(diǎn)，SignalP5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽，使用DNAMAN軟件對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)，再用MEGA 7.0軟件中的近鄰相接法(neighbor-joining,NJ)(1000 Bootstrap)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹 分析。

1.5 DoARID4基因的表達(dá)分析

DoARID4表達(dá)量檢測(cè)采用BIO-RAD公司生產(chǎn)的CFX96TMReal-Time System熒光定量PCR儀進(jìn)行。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s)，40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 10 s，65 ℃ 10 s，95 ℃ 5 s；反應(yīng)體系：10.0 μL熒光染料+0.5 μL F引物+0.5 μL R引物，ddH2O補(bǔ)齊到20.0 μL，每個(gè)樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)，以‘鐵棍山藥’的莖、葉為原材料，提取RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA模板，根據(jù)擴(kuò)增的序列設(shè)計(jì)定量引物(表1)。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因、qDoARID4為引物，檢測(cè)DoARID4在鐵棍山藥不同組織中的相對(duì)表達(dá)量，采用公式2-△△CT分析計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，Microsoft excel 2010處理數(shù)據(jù)，Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 DoARID4基因的克隆

以‘鐵棍山藥’嫩葉cDNA為模板，以表1中DoARID4為引物，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，獲得一條長(zhǎng)度為731 bp的條帶(圖1)，測(cè)序結(jié)果表明該基因開放閱讀框?yàn)?36 bp，編碼 211個(gè)氨基酸。

2.2 DoARID4基因預(yù)測(cè)氨基酸的一級(jí)結(jié)構(gòu) 分析

使用DNAMAN軟件對(duì)蛋白氨基酸序列進(jìn)行推導(dǎo)(圖2)，利用Protparam網(wǎng)站對(duì)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和氨基酸組成進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示：該蛋白的分子式為C1035H1606N304O305S17，氨基酸數(shù)211，理論分子質(zhì)量為23.73 ku，等電點(diǎn)PI為8.32。帶負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)21個(gè)，帶正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)24個(gè)，總原子數(shù)為 3 267。該蛋白不穩(wěn)定數(shù)值為40.57，預(yù)測(cè)其屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為69.76，說(shuō)明該蛋白有很強(qiáng)的脂溶性。

2.3 DoARID4蛋白疏水性/親水性分析

用 Protscale 對(duì)DoARID4蛋白疏水性/親水性在線分析，負(fù)值表示親水，正值表示疏水(圖3)，此蛋白的親水性的平均值(GRAVY)為-0.440，多肽鏈第198位的精氨酸具有最低的分值(-2.533)，親水性最強(qiáng)；第44位的亮氨酸具有最高的分值(1.400)，疏水性最強(qiáng)，從整體來(lái)看，由于負(fù)值較多，親水性氨基酸分布在整個(gè)肽鏈中占比較高。因此，該蛋白為親水性蛋白。

2.4 DoARID4蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用NetPhos 3.1網(wǎng)站對(duì)DoARID4蛋白磷酸位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)(圖4)，結(jié)果顯示，該蛋白預(yù)測(cè)含有14個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸磷酸位點(diǎn)7個(gè)；蘇氨酸磷酸位點(diǎn)6個(gè)；酪氨酸磷酸位點(diǎn)1個(gè)。

2.5 DoARID4蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)

通過(guò)Signal 4.0 Server 在線分析結(jié)果顯示，DoARID4蛋白最高信號(hào)肽分值為0.16，其第26位絲氨酸殘基可能是信號(hào)肽原始剪切位點(diǎn)，其最高剪切位點(diǎn)分值為0.115，從N端氨基酸開始到剪切位點(diǎn)處各氨基酸的平均信號(hào)肽分值為0.11，綜合分析表明DoARID4蛋白無(wú)信號(hào)肽，不是分泌蛋白。

2.6 DoARID4蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用PSORT網(wǎng)站分析該蛋白的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，DoARID4蛋白存在于核中的可能性為34.8%，存在于線粒體中的可能性最大為52.5%。

2.7 DoARID4蛋白跨膜預(yù)測(cè)

用TMHMM 對(duì)DoARID4蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)預(yù)測(cè)(圖5)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示DoARID4蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.8 DoARID4基因預(yù)測(cè)氨基酸的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

用PSIPRED對(duì)DoARID4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析(圖6)，在 DoARID4蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中 α 螺旋占24.17%、延伸鏈占9.48%、無(wú)規(guī)則卷曲占66.35%，說(shuō)明α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是DoARID4蛋白的主要結(jié)構(gòu)部件，如圖5。用 SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)DoARID4蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖7)。

2.9 DoARID4同源性以及系統(tǒng)進(jìn)化分析

將DoARID4蛋白序列和其他物種Arid蛋白用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖8)，進(jìn)化樹分析顯示：DoARID4與擬南芥Arid蛋白家族明顯地分為兩支，DoARID4和香芋ARID4親緣關(guān)系較近。

2.10 山藥 DoARID4在不同組織中的表達(dá)分析

為了分析DoARID4在不同組織中的表達(dá)模式，分別選取山藥豆播種后新長(zhǎng)出的新葉(未完全展開)、成熟葉(完全展開的功能葉)、地上莖、下地莖為材料，通過(guò)qRT-PCR技術(shù)分析DoARID4的組織特異性表達(dá)模式。結(jié)果顯示：DoARID4基因的相對(duì)表達(dá)量在不同的組織間存在差異，在地上莖中的表達(dá)是最高的，在新葉中的表達(dá)量最低(圖9)，推測(cè)山藥DoARID4基因可能與其生長(zhǎng)發(fā)育階段，代謝活躍程度等存在密切關(guān)系。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)‘鐵棍山藥’DoARID4基因在地上莖和地下莖中表達(dá)較高，而在葉片中表達(dá)較低，因?yàn)樯剿幥o和根分裂活動(dòng)比葉片強(qiáng)烈，推測(cè)DoARID4在山藥莖和根發(fā)育中發(fā)揮重要作用，在將來(lái)的研究中需要通過(guò)轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證其功能。2019年河南師范大學(xué)李明軍教授實(shí)驗(yàn)室建立了鐵棍山藥轉(zhuǎn)基因體系，通過(guò)山藥微莖塊建立山藥轉(zhuǎn)基因再生體系[15]。但是目前仍未報(bào)道過(guò)關(guān)于山藥轉(zhuǎn)基因方面的試驗(yàn)，可能與山藥再生能力有關(guān)。

植物再生能力由很多方面決定，除了植物本身的特性外，還有激素水平，另外就是基因決定。Xu等[4]研究水稻ARID3(OsARID3)功能發(fā)現(xiàn)該基因可以調(diào)控水稻再生體系，當(dāng)水稻OsARID3通過(guò)T-DNA插入技術(shù)突變后，改變了水稻再生能力，另外，OsARID3突變株系生長(zhǎng)素(IAA)含量升高，而OsARID3異戊烯基腺苷含量降低。筆者發(fā)現(xiàn)山藥莖和根部DoARID4基因含量高，可能DoARID4參與調(diào)控山藥莖和根的再生能力而影響畸形山藥的產(chǎn)生，具體功能仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

ARID蛋白普遍存在于真核生物中，是一個(gè)古老的DNA結(jié)合域[16]，其參與調(diào)控植物細(xì)胞的多種活動(dòng)，在植物生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞分化、基因表達(dá)調(diào)控中都發(fā)揮重要作用。該蛋白家族在高等植物(單子葉植物和雙子葉植物)以及低等植物(如蘚類)中都是保守的。擬南芥基因組編碼10個(gè)ARID蛋白，根據(jù)其C末端可分為4個(gè)亞家族。然而，這些ARID蛋白功能的研究鮮有報(bào)道，有關(guān)ARID蛋白的研究才剛起步。Roy等[17]對(duì)擬南芥ARID-HMG蛋白HMGB11的DNA-蛋白相互作用進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其更喜歡富含AT的DNA作為底物，并顯示超螺旋結(jié)構(gòu)偏向。然而，Kortschak等[6]研究表明ARID蛋白的DNA結(jié)合活性不一定是序列特異性的，因此有關(guān)DoARID4蛋白的DNA結(jié)合特性還有待進(jìn)一步研究。Xu等[4]研究發(fā)現(xiàn)OsARID3與水稻組培苗再生能力有關(guān)，其可以通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素合成基因OsYUC1，OsYUC6以及細(xì)胞分裂素合成基因OsIPT2，OsIPT7，改變愈傷組織中的激素水平，因此可以進(jìn)一步探究ARID功能，為難以建立再生體系的植物提供新的思路。

‘鐵棍山藥’DoARID4蛋白是一類脂溶性很強(qiáng)的、非跨膜蛋白，可能分布于細(xì)胞核及線粒體中，可以通過(guò)絲氨酸或蘇氨酸磷酸化識(shí)別細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)功能，可能參與調(diào)控山藥再生體能力而影響畸形山藥的產(chǎn)生。