巨大芽孢桿菌對(duì)商洛烤煙生長(zhǎng)及土壤微生物的影響

陳月星，黃金輝，劉翠霞，閆超超，張永鋒，李立丹

(1.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000；2.陜西秦嶺特色生物資源產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，陜西商洛 726000；3.商洛市煙草公司洛南分公司，陜西商洛 726000；4.陜西省煙草公司 商洛市公司，陜西商洛 726000)

中國(guó)是一個(gè)煙草大國(guó)，煙草產(chǎn)業(yè)在中國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要的地位，煙葉和卷煙產(chǎn)量均居世界首位，煙草種植面積為13 300 km2，年產(chǎn)量為 450萬(wàn)～500萬(wàn)t[1]。煙草栽培過(guò)程中，由于長(zhǎng)期連作和化肥的連年使用，導(dǎo)致植煙土壤結(jié)構(gòu)變差[2-3]、肥料利用率降低、肥力下降、土壤微生物多樣性減少[4-5]、病蟲(chóng)害加重等生產(chǎn)和生態(tài)問(wèn)題，嚴(yán)重制約著煙葉質(zhì)量風(fēng)格的形成和可持續(xù)健康發(fā)展。而改良土壤、培肥地力，構(gòu)建以“土壤-微生物-根系”為核心的高效健康的煙田微生態(tài)系統(tǒng)是解決這一問(wèn)題的途徑之一。

前人研究結(jié)果表明，施用微生物菌劑可促進(jìn)土壤養(yǎng)分吸收，提高煙葉品質(zhì)[6-9]，降低煙草病蟲(chóng)害發(fā)生率[10-11]，能夠改善土壤環(huán)境、實(shí)現(xiàn)土壤保育[12-15]，有利于煙區(qū)的健康和可持續(xù)發(fā)展，具有十分重要的生產(chǎn)、生態(tài)和經(jīng)濟(jì)效益?；诖?，本文通過(guò)田間試驗(yàn)研究巨大芽孢桿菌菌劑對(duì)秦嶺商洛地區(qū)烤煙的生長(zhǎng)及土壤微生物的影響，以期通過(guò)微生物菌劑的施用改善烤煙根際微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)烤煙生長(zhǎng)，提高煙葉產(chǎn)質(zhì)量。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

商洛地處秦嶺腹地，位于亞熱帶向暖溫帶過(guò)渡地帶，氣候溫和，山青水秀，林豐礦富。該區(qū)域光照資源豐富，日照時(shí)數(shù)為2 133.8 h，春夏日照時(shí)數(shù)最多，年均氣溫12.9 ℃，7月間氣溫最高 25 ℃左右，≥10 ℃的積溫為4 142.7 ℃，年降雨量800～900 mm，多集中在6至9月份，占全年降水量的50%以上。試驗(yàn)田位于陜西省商洛市洛南縣柏峪寺鎮(zhèn)薛樓村(34°10′2″N，110°20′5″E)，土壤基本理化性質(zhì)為：pH 5.47，有機(jī)質(zhì)8.60 g/kg，速效磷27.75 mg/kg，速效鉀 152.25 mg/kg。

1.2 供試材料

烤煙品種：‘云煙99’。

菌劑：巨大芽孢桿菌購(gòu)于北京航天恒豐科技股份有限公司，活菌含量為1×109CFU/g。

1.3 試驗(yàn)設(shè)置

按巨大芽孢桿菌施用量，試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)處理：對(duì)照CK(不施用菌劑)、A1(2 kg/667m2)、A2(6 kg/667m2)、A3(10 kg/667m2)、A4(14 kg/667m2)、A5(16 kg/667m2)，移栽時(shí)與定根水混溶施于煙株根部，每個(gè)處理重復(fù)3次，共18個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)4行，每行包含15株烤煙，每個(gè)小區(qū)共計(jì)60株，小區(qū)面積3.6 m×8.4 m，試驗(yàn)小區(qū)四周設(shè)置保護(hù)行(左右各2行，前后各3株煙)，各處理除微生物菌劑的施用外，其他操作與對(duì)照(CK)保持一致，均按本年度當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)操作要求執(zhí)行。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.4.1 煙株農(nóng)藝性狀觀測(cè) 各處理分別選取有代表性的煙株10株，于打頂后測(cè)定煙株的株高、莖圍、節(jié)距、單株有效葉片數(shù)、腰葉長(zhǎng)和寬。

1.4.2 主要經(jīng)濟(jì)性狀分析 各處理單獨(dú)采烤，進(jìn)行烤后煙葉外觀質(zhì)量鑒定，根據(jù)烤煙42級(jí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)烤后煙葉進(jìn)行分級(jí)，統(tǒng)計(jì)各處理煙葉的產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價(jià)及上中等煙比例等經(jīng)濟(jì)性狀。

1.4.3 土壤微生物群落特征分析 分別于移栽后30 d(團(tuán)棵期)、移栽后60 d(旺長(zhǎng)期)和移栽后90 d(成熟期)采集土樣，每個(gè)處理選取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙株3株，采用抖根法，收集抖落的根際土壤，混合后用無(wú)菌袋保存。

本研究應(yīng)用土壤小量DNA提取試劑盒(OMEGA，USA)提取土壤微生物總DNA，采用瓊脂糖凝膠DNA回收和純化試劑盒(天根，北京)進(jìn)行純化，應(yīng)用高通量測(cè)序的方法(Illumina Miseq Platform)測(cè)定16S rDNA基因序列V3片段分析煙株根際土壤微生物群落特征。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 采用 Microsoft Excel 2003整理數(shù)據(jù)，應(yīng)用SPSS 16.0軟件對(duì)煙草農(nóng)藝性狀和經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行方差分析，采用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較(P<0.05)。

使用Qiime2軟件中的DADA2插件對(duì)原始序列(input)進(jìn)行質(zhì)量控制(filtered)，去噪，拼接，并且去嵌合體，形成操作分類(lèi)單元(Operational Taxonomic Units, OTU)。對(duì)OTU進(jìn)行豐度、多樣性指數(shù)等分析，對(duì)物種進(jìn)行注釋并在門(mén)分類(lèi)水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的聚類(lèi)分析和統(tǒng)計(jì)比較分析，分析各處理之間的微生物群落結(jié)構(gòu)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨大芽孢桿菌對(duì)烤煙主要農(nóng)藝性狀的影響

由表1可知，施用巨大芽孢桿菌各處理的煙株的株高、莖圍、節(jié)距、單株有效葉片數(shù)、腰葉長(zhǎng)和寬均高于對(duì)照處理，其中A2處理各農(nóng)藝性狀與對(duì)照間差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)，A1和A5與對(duì)照差異不顯著，A3和A4在莖圍上顯著高于對(duì)照，其他農(nóng)藝性狀與對(duì)照無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，施用巨大芽孢桿菌有助于烤煙的生長(zhǎng)，其中A2處理效果最佳。

表1 烤煙主要農(nóng)藝性狀方差分析

2.2 巨大芽孢桿菌對(duì)烤煙主要經(jīng)濟(jì)性狀的影響

由表2可知，除667 m2產(chǎn)量外，菌劑各處理的667m2產(chǎn)值、均價(jià)和上等煙比例均顯著高于對(duì)照處理(P<0.05)，較對(duì)照分別提高0.4%～1.3%、3.4%～7.4%、2.1%～5.8%、2.8%～7.1%。其中A2處理各經(jīng)濟(jì)性狀最佳，667m2產(chǎn)值、均價(jià)和上等煙比例顯著高于其他處理(P< 0.05)。由此可見(jiàn)，施用巨大芽孢桿菌可提高烤煙的經(jīng)濟(jì)效益。

表2 烤煙主要經(jīng)濟(jì)性狀方差分析

2.1 巨大芽孢桿菌對(duì)烤煙根際土壤微生物的 影響

2.2.1 巨大芽孢桿菌對(duì)土壤微生物群落組成的影響 圖1為施用巨大芽孢桿菌后不同時(shí)期(F-移栽后30 d、S-移栽后60 d、T-移栽后90 d)土壤微生物群落組成門(mén)分類(lèi)水平的熱圖。由圖可知，移栽后30 d，土壤微生物主要優(yōu)勢(shì)菌群有變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)，與對(duì)照相比，巨大芽孢桿菌處理的樣品中厚壁菌門(mén)比例顯著提高。移栽后60 d，土壤微生物群落優(yōu)勢(shì)菌群主要有變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)。移栽后90 d，土壤微生物主要優(yōu)勢(shì)菌群為放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)(Gemmatimonadetes)和綠彎菌門(mén)。綜上可知，該區(qū)域土壤微生物主要優(yōu)勢(shì)菌群為變形菌門(mén)和放線菌門(mén)，該優(yōu)勢(shì)貫穿烤煙整個(gè)生育期，另有酸桿菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)等在特定時(shí)期表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，芽孢桿菌屬于厚壁菌門(mén)，該菌在施用后30 d表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)菌群，隨著生育期的推進(jìn)優(yōu)勢(shì)逐漸減弱。

2.2.2 不同時(shí)期土壤微生物群落多樣性指數(shù)分析 圖2為移栽后60 d，芽孢桿菌各水平處理土壤微生物群落多樣性指數(shù)，由圖可知，不同施用水平處理 Chao1多樣性指數(shù)、faith_pd、Simpson指數(shù)以及OTU數(shù)量均極顯著顯著高于對(duì)照(P<0.01)。其中chao1指數(shù)A4最高，其次為A1，且A1、A2和A5顯著高于對(duì)照(P<0.05)。除了A3處理與對(duì)照差異不顯著外，其他各處理faith_pd指數(shù)和OTU數(shù)量均顯著高于對(duì)照。Simpson指數(shù)在A1處理中最高，其次為A2和A3，芽孢桿菌各水平處理均顯著高于對(duì)照(P<0.05)。

2.2.3 群落組成差異分析 圖3為不同處理之間β多樣性分析PLS-DA圖，由圖可知對(duì)照與其他施用菌劑的處理距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明菌劑各水平處理與對(duì)照間差異較顯著，AUC曲線中所得比值為1，圖中所示施用菌劑各處理也存在明顯的差異，特別是移栽后30 d和90 d。移栽后60 d的分析結(jié)果中，A1與其他各處理差異顯著(P<0.05)，其余處理間差異不顯著。

3 討論與結(jié)論

本研究通過(guò)巨大芽孢桿菌不同施用量和對(duì)照進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果表明，施用巨大芽孢桿菌可有效促進(jìn)烤煙生長(zhǎng)，提高烤煙產(chǎn)量、產(chǎn)值、均價(jià)及上等中等煙比例，顯著增加烤煙經(jīng)濟(jì)效益，該結(jié)論與王勇乾等[15]、徐宗昌等[16]研究結(jié)果基本一致。同時(shí)，菌劑的施用改變了烤煙根際土壤微生物群落特征，本研究結(jié)果表明，該區(qū)域土壤微生物優(yōu)勢(shì)菌群主要為變形菌門(mén)和放線菌門(mén)，該菌群優(yōu)勢(shì)在烤煙生長(zhǎng)始末均一直保持，其他菌群在烤煙生長(zhǎng)的不同時(shí)期表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)或優(yōu)勢(shì)減弱，本試驗(yàn)采用的巨大芽孢桿菌為厚壁菌門(mén)，研究發(fā)現(xiàn)，在移栽后30 d時(shí)，該菌群優(yōu)勢(shì)明顯，隨著生育期的推進(jìn)，優(yōu)勢(shì)逐漸減弱，可能是到6月后，該地區(qū)溫度上升，雨量增加，致使其他細(xì)菌類(lèi)群繁殖旺盛，該菌群優(yōu)勢(shì)相對(duì)減弱。微生物多樣性指數(shù)在移栽后60 d，即烤煙旺長(zhǎng)期，各菌劑處理均顯著高于對(duì)照，且各處理間微生物群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

在農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中，土壤微生物具有不可忽視的作用，它們參與有機(jī)物的分解與合成、腐殖質(zhì)的形成及養(yǎng)分循環(huán)等重要的生態(tài)過(guò)程[17-18]。微生物菌劑的施用改變?cè)型寥牢⑸锶郝浣M成、群落結(jié)構(gòu)及種群多樣性，影響生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)、能量轉(zhuǎn)換和生態(tài)功能[19]，進(jìn)而影響烤煙的生長(zhǎng)。劉智炫等[13]研究表明，接種根際促生菌能降低煙田土壤容重和固相比，提高土壤總孔隙度，有利于烤煙生育后期土壤田間持水量的提高。王勇乾等[15]研究發(fā)現(xiàn)，解磷細(xì)菌肥配施磷肥可極顯著提高烤煙根際土壤有效磷含量和土壤微生物對(duì)碳水化合物、氨基酸以及胺類(lèi)碳源的利用能力。黃正強(qiáng)等[20]研究表明，沖施微生物菌劑增添了土壤中有益微生物菌群，提高了化肥利用率，促進(jìn)了煙草生長(zhǎng)發(fā)育，其中施用菌劑處理增產(chǎn)6.1%，凈增值223.83元/667m2。

綜上所述，施用微生物菌劑在一定程度上可通過(guò)改善土壤理化條件，促進(jìn)烤煙生長(zhǎng)，提高其經(jīng)濟(jì)效益，但是不同的菌劑種類(lèi)、施用時(shí)間、施用方式、施用量以及不同煙區(qū)，其效果不盡相同，因此，微生物菌劑的施用應(yīng)根據(jù)所在煙區(qū)存在的主要問(wèn)題，因時(shí)因地制宜，才能取得較理想的效果。