原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血絲氨酸蛋白酶抑制劑A1基因多態(tài)性分析*

吳曉楓，黃 怡，楊如杏，鄧少東，張靜瑩，官成濃，王 穎

原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是一種多見(jiàn)于中老年女性的慢性肝內(nèi)膽汁淤積性疾病，在北美和北歐國(guó)家發(fā)病率相對(duì)較高[1，2]。PBC患者臨床表現(xiàn)主要有乏力、皮膚瘙癢等，自然發(fā)病史包括臨床前期、無(wú)癥狀期、癥狀期和失代償期。由于該病在發(fā)病前進(jìn)展較為緩慢，可長(zhǎng)達(dá)10～15年，通過(guò)檢測(cè)可靠的生物標(biāo)志物對(duì)該病進(jìn)行早期篩查具有重要的臨床意義[3，4]。既往研究[5，6]發(fā)現(xiàn)，基因遺傳多態(tài)性可能是個(gè)體間PBC易感性差異的重要原因，已有多個(gè)基因被報(bào)道與不同人種PBC易感性有關(guān)。絲氨酸蛋白酶抑制劑A1基因(serine protease inhibitor A1，SERPINA1)是α1-抗胰蛋白酶家族(α1-antitrypsin family，AAT)的重要成員[7]，已有國(guó)外學(xué)者報(bào)道SERPINA1 基因多態(tài)性與PBC易感性存在關(guān)聯(lián)，但有關(guān)結(jié)論還存在不一致性[8，9]。本研究檢測(cè)了62例PBC患者外周血SERPINA1基因多態(tài)性，旨在為該病的臨床診治和發(fā)病機(jī)制研究提供有價(jià)值的資料，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2018年3月～2020年3月在我院就診的PBC患者62例，診斷符合《原發(fā)性膽汁性肝硬化診斷和治療共識(shí)(2015年)》的標(biāo)準(zhǔn)[10]，排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有病毒性肝炎或藥物性肝損傷；②患有嚴(yán)重的心、腦、血液系統(tǒng)疾病和感染性疾??；③入院前接受過(guò)相關(guān)藥物治療；④有精神狀態(tài)異常。另選擇同期在我院體檢的健康人群60例作為對(duì)照組，所有納入對(duì)象均對(duì)本研究知情同意，研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)。

1.2 外周血基因提取和單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)位點(diǎn)基因分型檢測(cè) 抽取外周血3 mL，采用酚-氯仿法提取DNA，使用NanoDrop公司提供的NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度和純度，將合格標(biāo)本保存于-20℃冰箱備用。針對(duì)SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物，上游引物rs28929474-F：5′-TCCAGGCCGTGCATAAGG-3′，下游引物rs28929474-F：5′-GCCCCAGCAGCTTCAG-3′，引物交由南京擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為20μL：DNA模板1μL，PCR反應(yīng)液10μL，上、下游引物各1μL，雙蒸水7μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 42 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min。取PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行確認(rèn)。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，將純化后的產(chǎn)物送南京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，對(duì)SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)基因型和等位基因進(jìn)行分析和記錄。

1.3 血清自身抗體檢測(cè) 使用YHLO公司生產(chǎn)的自身免疫性肝病抗體譜檢測(cè)試劑盒(免疫印跡法) 檢測(cè)血清自身抗體；采用歐蒙公司生產(chǎn)的檢測(cè)抗線(xiàn)粒體抗體譜( anti-mitochondrial antibody，AMA) 試劑盒(歐蒙斑點(diǎn)法)。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料 兩組性別、年齡、BMI差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組SERPINA1基因rs28929474位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較 兩組人群外周血SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)基因型分布符合哈迪-溫伯格平衡(P>0.05)，具有群體代表性。PBC患者與健康人基因型分布頻率存在顯著性差異(P>0.05)；PBC患者AA基因型和A等位基因頻率顯著高于對(duì)照組(P>0.05)，而GG、GA基因型和G等位基因顯著低于對(duì)照組(P>0.05，表2)，提示A等位基因是患者發(fā)生PBC的保護(hù)性因素，而G等位基因可能是患者發(fā)生PBC的風(fēng)險(xiǎn)因素。

表2 兩組SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)基因型和等位基因頻率(%)分布比較

2.3 不同基因型PBC患者Child評(píng)分和MELD評(píng)分比較 攜帶GA/AA型PBC患者Child評(píng)分和MELD評(píng)分顯著高于GG型PBC患者(P>0.05)，兩組血清抗核抗體(ANA)和AMA-M2抗體陽(yáng)性率比較無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05，表3)。

表3 不同基因型PBC患者肝功能評(píng)分和血清自身抗體陽(yáng)性率比較

3 討論

PBC患者肝組織病理學(xué)表現(xiàn)主要有進(jìn)行性、非化膿性、破壞性肝內(nèi)小膽管炎、伴門(mén)管區(qū)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肝纖維化等。近年來(lái)，隨著AMA檢查的逐漸普及，PBC的確診率有了明顯的提升[11]。研究發(fā)現(xiàn)，PBC患者住院期間發(fā)生醫(yī)院感染風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，較普通人可增加5倍以上，除自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎外，還可引發(fā)尿路感染、肺部感染和血流感染，這些合并癥可進(jìn)一步導(dǎo)致病情的進(jìn)展，導(dǎo)致患者出現(xiàn)肝衰竭，甚至死亡，是患者不良預(yù)后的重要原因。PBC可伴發(fā)皮膚、關(guān)節(jié)和腺體的自身免疫性疾病，如硬皮病、干燥綜合征等，在臨床上受到實(shí)驗(yàn)室條件、臨床醫(yī)生對(duì)疾病認(rèn)知不足等因素的限制，導(dǎo)致該病常被誤診為病毒性肝炎、肝炎肝硬化或結(jié)締組織病，不但延誤了治療時(shí)機(jī)，還增加了治療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)成本，影響患者預(yù)后。目前，已有C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)等可供檢測(cè)，但由于PBC患者長(zhǎng)期處于全身性慢性炎癥狀態(tài)，這些血液學(xué)指標(biāo)的判斷效能不足，篩選出可靠的血液生物標(biāo)志物對(duì)該病進(jìn)行提前診斷和治療具有重要的意義[12，13]。

研究[14]發(fā)現(xiàn)PBC發(fā)病存在一定的家族聚集性和性別差異，女性患病率明顯升高，說(shuō)明PBC是一種受到個(gè)體間遺傳多態(tài)性影響的疾病。已有研究發(fā)現(xiàn)漢族人群PBC發(fā)病與CD58基因、CD28基因、CD80基因、STAT4基因、IL-21基因、IL-12A基因等存在關(guān)聯(lián)[15-19]。絲氨酸蛋白酶家族蛋白分子量大小約為40～50 kD，主要通過(guò)影響基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性參與細(xì)胞外基質(zhì)的水解過(guò)程，對(duì)機(jī)體炎癥反應(yīng)、細(xì)胞遷移、纖維蛋白溶解、細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程產(chǎn)生重要的影響[20，21]。SERPINAI是一種高度保守的急性期時(shí)相反應(yīng)蛋白，主要在肝臟合成和分泌，在其他組織細(xì)胞如腸上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞也產(chǎn)生[22]。在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織SERPINA蛋白表達(dá)增加，且與患者預(yù)后不良有關(guān)[23]。在先兆子癇孕婦，尿液SERPINA mRNA水平上調(diào)，被認(rèn)為是評(píng)估先兆子癇病情嚴(yán)重程度的有潛力的生物標(biāo)志物[24]。肺氣腫患者SERPINA1基因變異與肺功能改變有關(guān)[25]。研究發(fā)現(xiàn)[26]，SERPINAI基因rs8004738位點(diǎn)多態(tài)性與中國(guó)人群慢性阻塞性肺疾病存在關(guān)聯(lián)。本研究采用基因測(cè)序法對(duì)本地區(qū)PBC患者外周血SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)主要包含GG、GA、AA基因型，而PBC患者AA基因型、A等位基因頻率顯著高于健康人，經(jīng)Logistic回歸分析結(jié)果也顯示了攜帶G等位基因是攜帶A等位基因型患者發(fā)生PBC風(fēng)險(xiǎn)的2.32倍，表明該位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性與本地區(qū)居民PBC易感性存在一定的關(guān)聯(lián)。

Child評(píng)分和MELD評(píng)分是臨床評(píng)估肝硬化患者肝臟功能的指標(biāo)，對(duì)于PBC患者預(yù)后也有一定的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究進(jìn)一步分析了攜帶不同基因型PBC患者Child評(píng)分和MELD評(píng)分及ANA、AMA-M2抗體陽(yáng)性率的差異，結(jié)果顯示攜帶GA/AA型PBC患者Child評(píng)分和MELD評(píng)分更高，但ANA和AMA-M2陽(yáng)性率無(wú)顯著性差異。本研究結(jié)果顯示了SERPINA1基因rs28929474位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)于判斷PBC患者病情也有一定的價(jià)值，推測(cè)其原因可能是：SERPINA1在基因水平上的變異可能改變SERPINA1 蛋白轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而對(duì)肝細(xì)胞細(xì)胞外基質(zhì)清除、炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生影響，導(dǎo)致對(duì)PBC的易感性差異[27，28]。SERPINA1 基因可能存在多處多態(tài)性位點(diǎn)而對(duì)PBC易感性產(chǎn)生影響，其它位點(diǎn)對(duì)PBC易感性的影響以及不同位點(diǎn)之間的交互效應(yīng)有待進(jìn)一步研究和完善。肝硬化涉及免疫反應(yīng)發(fā)病機(jī)制，目前研究尚未明確，臨床上也無(wú)有效藥物逆轉(zhuǎn)肝硬化的進(jìn)程。因此，在患者疾病發(fā)生早期采取有效的干預(yù)和管理措施，對(duì)相關(guān)并發(fā)癥進(jìn)行充分的預(yù)防，對(duì)于提高患者生存期，改善患者預(yù)后具有重要的意義。

綜上所述，本研究結(jié)果證明了本地區(qū)居民發(fā)生PBC可能與SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)多態(tài)性有關(guān)，其中A基因可能是保護(hù)基因，而G基因可能是風(fēng)險(xiǎn)基因。監(jiān)測(cè)外周血SERPINA1 基因rs28929474位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)于預(yù)測(cè)PBC的發(fā)生可能具有一定的臨床意義。