曲美他嗪對(duì)急性肝衰竭小鼠肝組織NOX2和NOX4表達(dá)的影響

汪 婭，羅婷婷，李 璨，趙文靜，陸 爽

藥物、酒精、嗜肝病毒、肝臟低灌注等諸多因素可造成肝細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)大規(guī)模死亡，肝功能喪失，發(fā)展為急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)，其病死率高達(dá)95%[1，2]。肝移植是目前明確唯一能挽救ALF患者生命的治療方法。然而，限于供體的嚴(yán)重缺乏、巨額醫(yī)療費(fèi)用和手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)等原因，肝移植還不能廣泛開展[3]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)確實(shí)有效的干預(yù)靶點(diǎn)和特效治療ALF的藥物。曲美他嗪 (trimetazidine，TMZ)，其化學(xué)名稱為1-(2，3，4-三甲氧芐基)-苯甲基哌嗪，是哌嗪類衍生物，首先作為抗心絞痛藥物應(yīng)用于臨床，是治療急慢性心力衰竭的重要藥物[4，5]。該藥具有抗氧化作用，增強(qiáng)清除超氧化物和羥基的能力，減少丙二醛(MDA)生成和氧自由基對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的損害，保護(hù)細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[6]。近年來(lái)，有研究發(fā)現(xiàn)曲美他嗪可顯著減輕缺血再灌注肝損傷并有促進(jìn)肝細(xì)胞再生的治療效果[7]。本研究應(yīng)用D-氨基半乳糖聯(lián)合脂多糖(lipopolysaccharide/D-galactosamine，D-Galn/LPS)誘導(dǎo)小鼠ALF模型，以鹽酸曲美他嗪作為干預(yù)藥物，從氧化應(yīng)激改變方面探討了曲美他嗪對(duì)ALF小鼠的保護(hù)作用及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 D-Galn購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，LPS購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，兔抗鼠NOX2、抗NOX4 和抗GAPDH購(gòu)于美國(guó)Abcam公司，檢測(cè)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙二醛(MDA)、過(guò)氧化物酶(CAT)試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，鹽酸曲美他嗪片購(gòu)于施維雅(天津)制藥有限公司，還原型谷胱甘肽片購(gòu)于重慶藥友制藥有限公司。LEICA顯微鏡和OlympusBX41圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)，酶標(biāo)儀(BIO-RAD公司)。

1.2 動(dòng)物模型的制備 65只6～8周齡的雄性C57BL/6小鼠購(gòu)自重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，隨機(jī)將小鼠分為6組，即對(duì)照組(n=10)、模型組(n=15)、小、中、大劑量曲美他嗪組(n=10)和還原型谷胱甘肽處理組(n=10)，給予對(duì)照組生理鹽水腹腔內(nèi)注射；在模型組，將D-Galn 500 mg 和LPS 50 μg加入無(wú)菌生理鹽水10 ml，制備成50 mg D-Galn/5 μg LPS/ml溶液，取300 mg D-Galn/10 μg LPS.kg-1腹腔內(nèi)注射；在小、中、大劑量鹽酸曲美他嗪組，將鹽酸曲美他嗪10 mg溶于無(wú)菌生理鹽水10 ml，制備成1 mg/ml溶液，分別以5 mg.kg-1.d-1、10mg.kg-1.d-1和20 mg.kg-1.d-1灌胃，持續(xù)1 w后處理同模型組；將還原型谷胱甘肽片10 mg制備成1 mg/ml溶液，以20 mg.kg-1.d-1灌胃，持續(xù)1 w后處理同模型組。各組小鼠均在處理6 h后處死。從眼球靜脈收集血液，分離血清。取部分肝組織，制備10%組織勻漿。取上清液。經(jīng)門靜脈灌注，收集各組相同部位肝組織，用低聚甲醛溶液固定48 h，制片。

1.3 肝組織 NOX2/4 mRNA水平和蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR法，取凍存的肝組織50 mg，抽提組織總RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄試劑，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。取cDNA加入SYBR熒光染料和上下游引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格設(shè)立內(nèi)參照GAPDH；在指數(shù)區(qū)內(nèi)設(shè)定參數(shù)，讀取CT值，經(jīng)負(fù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)化后，用目的片段與內(nèi)參片段的比值作為該標(biāo)本目的基因水平；采用Western blot法，提取各組肝組織總蛋白，用BCA法檢測(cè)肝臟蛋白濃度，使各組蛋白濃度一致，加入蛋白上樣緩沖液，煮15 min，使蛋白變性，各組取相同體積的蛋白樣品，進(jìn)行12%SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉。然后，分別加入抗NOX2和抗NOX4，孵育過(guò)夜，次日用TBST清洗后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育50 min，曝光，使用掃膜儀掃描并采圖，并應(yīng)用軟件分析目的蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 各組肝組織病理學(xué)表現(xiàn) 與對(duì)照組比，模型組小鼠肝細(xì)胞壞死嚴(yán)重，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組小鼠肝組織病理學(xué)損傷均有所改善(圖1)。

圖1 各組小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE，200×)A:對(duì)照組；B:模型組；C:谷胱甘肽處理組；D:小劑量曲美他嗪處理組；E:中劑量曲美他嗪處理組；F:大劑量曲美他嗪處理組

2.2 各組血清ALT和AST水平比較 與對(duì)照組比，模型組血清ALT和AST水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組血清ALT和AST水平顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組血清ALT和AST水平比較

2.3 各組肝組織勻漿MDA和CAT含量變化 與對(duì)照組比，模型組MDA含量升高，而CAT含量降低(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組MDA含量顯著降低，而CAT含量顯著升高(P<0.05，表2)。

表2 各組肝組織MDA和CAT水平比較

2.4 各組肝組織NOX2/4 mRNA水平比較 與對(duì)照組比，模型組NOX2/4 mRNA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組NOX2/4 mRNA水平顯著減低(P<0.05，表3)。

表3 各組肝組織NOX2/4 mRNA水平比較

2.5 各組肝組織NOX2/4 蛋白表達(dá)量變化 與對(duì)照組比，模型組NOX2/4 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著增強(qiáng)(P<0.05)；與模型組比，中、大劑量曲美他嗪處理組NOX2/4 蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著減弱(P<0.05，表4)。

表4 各組肝組織NOX2/4 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 各組小鼠肝組織NOX2/4蛋白表達(dá)情況A:對(duì)照組；B:模型組；C:谷胱甘肽處理組；D:小劑量曲美他嗪處理組；E:中劑量曲美他嗪處理組；F:大劑量曲美他嗪處理組

3 討論

ALF是一種罕見且嚴(yán)重的綜合征，在沒(méi)有已知潛在慢性肝病患者的肝臟受到急性打擊后，正常肝功能迅速惡化，表現(xiàn)為黃疸、凝血功能障礙、肝性腦病為特征，患者多因并發(fā)多器官衰竭而死亡，其病死率極高。氧化應(yīng)激是指細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)過(guò)度產(chǎn)生, 內(nèi)源性抗氧化防御功能減弱，致使兩者之間不平衡，引起組織或細(xì)胞損傷的狀態(tài)。氧化應(yīng)激是許多肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制，在肝臟疾病的發(fā)展過(guò)程中起著重要作用[8-11]。

LPS是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)毒素的主要成分。有研究報(bào)道LPS可以誘導(dǎo)NOX激活[21]。同時(shí)，肝臟kuffer細(xì)胞中的吞噬型NOX(即NOX2)可被細(xì)菌產(chǎn)物(如LPS)激活產(chǎn)生大量的ROS[22]。 D-Galn是肝細(xì)胞磷酸尿嘧啶核苷干擾劑，可造成肝細(xì)胞彌漫性壞死和炎癥。有研究者使用Galn/LPS誘導(dǎo)大鼠ALF模型，觀察到與對(duì)照組相比，ALF大鼠肝組織NOX4蛋白表達(dá)顯著增加[23]。

曲美他嗪是一種游離脂肪酸氧化抑制劑。研究發(fā)現(xiàn)曲美他嗪抑制NOX2能改善糖尿病相關(guān)的心肌病[24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，曲美他嗪干預(yù)可減輕D-Galn/LPS誘導(dǎo)的ALF小鼠肝損傷程度，中、大劑量曲美他嗪灌胃小鼠血清ALT和AST水平下降，肝組織勻漿MDA含量降低，而CAT含量升高。同時(shí)，NOX2/4水平減低。以上結(jié)果表明曲美他嗪可能通過(guò)下調(diào)肝組織NOX2/4表達(dá)，減輕氧化應(yīng)激損傷，改善D-Galn/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭。本研究以鹽酸曲美他嗪為干預(yù)藥物，從NOX2/4介導(dǎo)的氧化應(yīng)激方向探究了抗氧化劑對(duì)ALF的保護(hù)作用，進(jìn)一步提供了對(duì)ALF發(fā)病機(jī)制的深入了解，期望對(duì)ALF的抗氧化治療提供新的思路。本研究未在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗(yàn)證曲美他嗪下調(diào)肝組織NOX2/4表達(dá)的機(jī)制，后續(xù)將進(jìn)行深入研究。