云南景邁古茶園茶葉內(nèi)生真菌多樣性初步研究

張建坤，周 劍，彭 超，王 琴，汪 飛，王振華

（1.武漢理工大學(xué)，武漢 430070；2.思茅海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心，云南 普洱 665000；3.中國質(zhì)量認(rèn)證中心武漢分中心，武漢 430062；4.武漢海關(guān)技術(shù)中心，武漢 430054）

早在1884 年，Heinrich Anton de Bary 提出內(nèi)生菌（Endophyte）一詞，指在植物組織中存在的任何微生物體?，F(xiàn)在認(rèn)為，在植物生命的某一段時(shí)間內(nèi)，完全或部分生活史階段可以在植物組織內(nèi)部定殖且不對(duì)宿主本身造成明顯傷害的微生物都是內(nèi)生菌。自1898 年Vogl 于黑麥草（Lolium perenneL.）的種子中分離得到第一個(gè)內(nèi)生真菌以來，植物組織中內(nèi)生真菌便一直倍受研究者關(guān)注。這些內(nèi)生真菌在陸地生態(tài)系統(tǒng)中起著關(guān)鍵作用，極大地影響著植物個(gè)體的生長發(fā)育、種群進(jìn)化、群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境適應(yīng)性［1］。迄今為止，認(rèn)為植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是對(duì)植物貢獻(xiàn)最大的一類內(nèi)生菌。內(nèi)生真菌不僅在宿主植物內(nèi)發(fā)揮多種重要作用，也是人類孜孜以求的珍貴真菌資源，大量研究表明，部分內(nèi)生真菌在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域顯示了良好的應(yīng)用前景［2-4］。

茶樹（Camellia sinensis）是一種原產(chǎn)中國的常綠喬木，茶葉中富含多胺、多酚、咖啡因、花青素和其他成分，茶飲品成為人類最為喜愛的飲品之一。茶樹全株都有內(nèi)生真菌分布，與茶葉的品質(zhì)和茶飲品的口感密切相關(guān)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至2020 年9 月份，已經(jīng)報(bào)道的茶樹內(nèi)生真菌包括3 門5 綱14 目24 科34 屬，其中刺盤孢菌（Colletotrichumspp.）、間座殼菌（Dia?porthespp.）、青霉菌（Penicilliumspp.）和木霉菌（Trichodermaspp.）是茶樹的優(yōu)勢內(nèi)生真菌［5］。研究表明，地理環(huán)境、茶樹種類與品種、不同組織對(duì)內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群分布和群落結(jié)構(gòu)都有決定性的影響［6，7］。本研究以云南省景邁縣千年古茶園茶葉為研究對(duì)象，分離并鑒定了干燥茶葉的內(nèi)生真菌，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)新的茶葉內(nèi)生真菌和多個(gè)新的真菌種，初步揭示了古茶園茶葉內(nèi)生真菌的多樣性和特異性。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存

2017年10月，從中國云南省景邁縣惠民鄉(xiāng)景邁村和芒景村的一處古茶園中采集茶葉樣品。古茶園已有1 300 多年的普洱茶種植歷史，種植面積1 800 hm2。取樣茶樹樹齡都在千年以上，株高2~10 m。隨機(jī)選擇植株，采集有或無明顯病害癥狀的茶葉，將同一株茶樹的茶葉放入一個(gè)無菌塑料袋中，48 h 內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室。除少數(shù)樣品用于病原菌分離外，其余樣品裝入牛皮紙袋中自然干燥，室溫保存。

1.2 內(nèi)生真菌分離與純化

挑選健康、無明顯病斑的干燥茶葉，用自來水沖洗2 次，75% 乙醇浸泡60 s，再用0.5% 次氯酸鈉浸泡3 min，75% 乙醇漂洗30 s，最后用無菌蒸餾水洗滌3次，用于茶葉表面殺菌。用無菌剪刀將表面殺菌后的茶葉剪成大小0.2 cm×0.2 cm（長×寬）的葉組織塊。取4 個(gè)葉組織塊均勻地放置于PDA 平板周邊，每片茶葉重復(fù)接種3 個(gè)平板。作為對(duì)照，加入100 μL 最后一次洗滌水于相同的平板中，以檢驗(yàn)表面殺菌的效果。用封口膜密封培養(yǎng)皿，于恒溫培養(yǎng)箱中（25±0.3）℃培養(yǎng)7 d，定期檢查菌絲生長情況。將具有明顯真菌菌落特征的菌絲轉(zhuǎn)接至新的PDA 平板中，（25±0.3）℃培養(yǎng)，以獲得純培養(yǎng)物。

1.3 內(nèi)生真菌ITS 擴(kuò)增

將真菌純培養(yǎng)物接種于含15 mL PDB 的100 mL錐形瓶中，在（25±0.3）℃條件下靜置培養(yǎng)7 d。菌絲經(jīng)過濾后，在液氮中充分研磨成粉末，用于基因組DNA 提取。用PureLinkTM植物基因組DNA 純化試劑盒（Invitrogen，Thermofisher，Shanghai，China）提取基因組DNA，操作步驟按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。用保守引物ITS1F 和ITS4R 進(jìn)行PCR，擴(kuò)增rDNA 的ITS（In?ternal Transcribed Spacer）序列，或用引物EF1-728F和EF1-986R 擴(kuò)增TEF（Translation Elongation Fac?tor）基因（表1）。

表1 茶葉內(nèi)生真菌ITS 和TEF 的PCR 引物和擴(kuò)增條件

用1.5% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，DNA片段大小預(yù)計(jì)在450~700 bp（ITS）或180~250 bp（TEF）。

1.4 DNA 測序與系統(tǒng)進(jìn)化分析

PCR 產(chǎn)物直接送至上海生工公司測序。將所得序列用BLASTn 程序（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov）在GenBank 數(shù)據(jù)庫中搜索最佳匹配序列。在MEGA7.0中，用Clustal W 對(duì)DNA 序列進(jìn)行多重比對(duì)，用鄰接法（Neighbour Joining Method）構(gòu)建DNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 分析重復(fù)1 000 次。

2 結(jié)果與分析

在PDA 平板上共接種486 個(gè)葉組織塊，獲得103 個(gè)純培養(yǎng)的真菌分離物，分離率為21.2%。根據(jù)菌落的形態(tài)學(xué)特征，從中選取30 個(gè)真菌分離物，進(jìn)行ITS 的PCR 和測序。分離物1 未能獲得測序結(jié)果，后改用TEF 引物進(jìn)行PCR 和測序，從而獲得TEF 基因的序列。30 份DNA 序列已提交至GenBank 相關(guān)數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)為MZ617296-MZ617324。

Blastn 搜索和比對(duì)結(jié)果顯示，30 個(gè)分離物分別屬于2 門3 綱7 目11 科13 個(gè)屬（表2），其中23 個(gè)是子囊菌，余下6 個(gè)是擔(dān)子菌，分離物20 為糞殼菌綱（Sordariomycetes）真菌，但未獲得屬一級(jí)水平的分類信息。屬于鬼傘屬（Coprinellus）的分離物最多，有6個(gè)，占比為20.0%，是茶葉樣品中內(nèi)生真菌的優(yōu)勢屬，多節(jié)孢屬（Nodulisporium，16.7%）、炭團(tuán)菌屬（Hy?poxylon，13.3%）和輪層炭菌屬（Daldinia，10.0%）依次排在其后。

用鄰接法構(gòu)建了29 個(gè)分離物的ITS 系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1），23 個(gè)子囊菌分離物和6 個(gè)擔(dān)子菌分離物構(gòu)成發(fā)育樹的2 個(gè)大支。分離物24 是子囊菌，與對(duì)應(yīng)的最佳匹配分離物的序列相似性僅有90.87%，E值為5e-172（表2），表明該分離物與最佳匹配分離物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，在發(fā)育樹上與同是炭團(tuán)菌的分離物14、17 和25 相差甚遠(yuǎn)，獨(dú)自構(gòu)成一個(gè)分支。分離物5、6、10、18、21、26 同為鬼傘屬，在進(jìn)化樹中構(gòu)成同一分支，且自展值為100，較為可信。然而，分離物6、10、18、21、26 與對(duì)應(yīng)分離物的序列相似性都只有96% 左右（表2），與同為鬼傘菌的分離物5 也存在一定差異。

圖1 茶葉內(nèi)生真菌ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 茶葉內(nèi)生真菌的可培養(yǎng)分離物a

3 討論

本研究以云南景邁古茶園的普洱茶葉為試驗(yàn)材料，用平板培養(yǎng)法從儲(chǔ)存3 年多的干燥茶葉樣品中分離內(nèi)生真菌。盡管內(nèi)生真菌的分離率比較低，僅21.2%，與常規(guī)的新鮮茶葉達(dá)到80% 或更高的分離率相距甚遠(yuǎn)，但仍獲得了13 個(gè)屬的內(nèi)生真菌分離物，初步展示了古茶園茶葉內(nèi)生真菌的多樣性。

與以往報(bào)道不同，本研究沒有分離到常見的茶樹內(nèi)生真菌，如青霉菌、炭疽菌（Colletotrichumspp.）、鐮刀菌（Fusariumspp.）、間座殼菌、擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsisspp.）、莖點(diǎn)霉菌（Phomaspp.）、擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsisspp.），但也分離到了常見的木霉菌和鏈格孢菌（Alternariaspp.）［5-10］。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，本研究獲得的1 目4 科8 屬共20 個(gè)真菌分離物是新發(fā)現(xiàn)的茶樹內(nèi)生真菌，其中所有的碳團(tuán)菌、多節(jié)孢菌（Nodulisporiumspp.）、鬼傘菌等分離物都未曾在茶樹植物中報(bào)道過（表3）。有報(bào)道顯示，用PDA 平板培養(yǎng)法分離云南省一處野生茶園茶葉的內(nèi)生真菌，但沒有分離到這8 個(gè)屬的內(nèi)生真菌［11］。還有研究表明，用二代測序技術(shù)分析茶葉的內(nèi)生真菌，在檢測到的35 個(gè)高相對(duì)豐度的OTU（Operation?al Taxonomic Unit）（科一級(jí)水平）中，也沒有檢測到本研究分離到的這8 個(gè)屬的內(nèi)生真菌［12］。此外，分離物24 與對(duì)應(yīng)的最佳匹配分離物的序列相似性僅90.87%，極可能是真菌界里的新種或新屬，而分離物6、10、18、21、26 與對(duì)應(yīng)分離物的序列相似性也只有96% 左右，可能是鬼傘屬的新種，需要后續(xù)鑒定才能確定它們的分類地位。

表3 本研究新發(fā)現(xiàn)的茶葉內(nèi)生真菌分離物

云南景邁、芒景境內(nèi)的千年古茶園是目前世界上保存最完好、年代最久遠(yuǎn)、面積最大的自然茶園。古茶園有近乎封閉的自然環(huán)境，人為干預(yù)少，其內(nèi)生菌種類和其他人工栽培茶園應(yīng)該存在較大的區(qū)別，本研究結(jié)果證明了這一點(diǎn)。此外，本研究采用的干燥茶葉樣品也可能是造成這種差別的重要原因，干燥可能改變了部分茶葉內(nèi)生真菌的群落結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致了內(nèi)生真菌在PDA 平板上的不同生長格局，最終產(chǎn)生了與新鮮茶葉不同的結(jié)果，顯示了云南景邁古茶園茶葉內(nèi)生真菌的特異性。

本研究結(jié)果只是揭示了云南景邁古茶園茶葉內(nèi)生真菌多樣性的冰山一角，但為后續(xù)茶樹內(nèi)生真菌的研究提供了參考。如果以新鮮茶樹樣品作試驗(yàn)材料、組合使用多種培養(yǎng)平板等，應(yīng)該可以分離到更多種類的內(nèi)生真菌。如果平板培養(yǎng)法與高通量的二代測序技術(shù)相結(jié)合，則可以更多地揭示茶樹內(nèi)生真菌的多樣性。據(jù)此，可以解釋古茶園茶樹內(nèi)生真菌的生態(tài)學(xué)意義，還可以發(fā)掘更多有價(jià)值的真菌種類，為未來在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、環(huán)境等應(yīng)用領(lǐng)域提供寶貴的真菌資源。