壯藥穿根藤質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

洪影雯，謝澤碧，梁子寧

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530001；2.廣西梧州制藥（集團(tuán)）股份有限公司，廣西 梧州 543000）

穿根藤為茜草科九節(jié)屬植物蔓九節(jié)（Psychotria serpensL.）的干燥全株，又名匍匐九節(jié)、伸筋藤、石邦子、上木蛇、風(fēng)不動藤等［1-3］，是廣西壯族民間常用草藥。主要分布于廣西、廣東、福建、浙江、臺灣和海南等省區(qū)［1，2］，廣西多分布于上思、防城、玉林、北流、博白、柳州、蒼梧等地［3］。該品性平，味苦、辛，歸肝經(jīng)［1，2］。具有祛風(fēng)除濕、舒經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛等功效，主要治療風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、手足麻木、腰肌勞損、坐骨神經(jīng)痛、多發(fā)性癰腫、骨結(jié)核、跌打損傷、骨折、毒蛇咬傷等［1-3］。在民間有較長的使用歷史，始載于《廣西本草》《中國壯藥資源名錄》，但《中國藥典》及《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》尚無收載。蔓九節(jié)中主要含有環(huán)烯醚萜苷類、三萜類、甾醇類以及大量黃酮類及其他類成分［4-7］。通過查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)對蔓九節(jié)的研究較少，主要集中在性狀［8，9］、顯微［10］及DNA 分子方面的研究［11，12］，尚未見有關(guān)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)方面的報道。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)，蔓九節(jié)中含有車葉草苷成分，依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)［13-15］，確定了車葉草苷的含量測定方法。為確保其臨床用藥的安全性和有效性，通過鑒別研究、常規(guī)檢查、浸出物及車葉草苷含量測定，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

車葉草苷對照品，上海士鋒生物科技有限公司，批號18032716；穿根藤藥材分別采于廣西壯族自治區(qū)內(nèi)不同產(chǎn)地，共15 個批次，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物教研室梁子寧教授鑒定其為茜草科植物蔓九節(jié)的全株，來源見表1。所用試劑均為分析純。

表1 穿根藤來源信息

ZF-20C 型暗箱三用紫外分析儀，上海精密儀器儀表有限公司；尼康生物顯微鏡Eclipse E200MV，南京橫橋儀器有限公司；1260 系列高效液相色譜儀，包括G-1311C 高壓四元泵，二極管陣列檢測器，1260 series 色譜工作站，美國安捷倫科技公司。

1.2 鑒別

1.2.1 藥材性狀鑒別 主根不明顯。干燥莖呈圓柱形，有許多不定根，周皮青褐色至深棕色，具細(xì)縱紋，質(zhì)硬，易折斷，斷面米黃色。干燥葉多皺縮，對生，全緣，稍反卷，展平后呈卵形或橢圓形，長1~3 cm，寬0.8~2.5 cm；先端漸尖或急尖，基部楔形，葉面暗綠色，背面葉黃綠至灰綠色，葉稍革質(zhì)。果實為核果，扁球形（圖1）。

圖1 穿根藤藥材

1.2.2 根橫切面顯微鑒別 類圓形。最外為2~3 層木栓層細(xì)胞，排列緊密。木栓形成層不明顯。栓內(nèi)層與皮層9~10 層細(xì)胞，占根的橫切面約1/4，分界不明顯，細(xì)胞圓形或類圓形，其內(nèi)側(cè)胞腔較大的細(xì)胞中含針晶束且斷續(xù)成環(huán)。內(nèi)皮層不明顯。維管束為無限外韌型。韌皮部由篩管、伴胞、韌皮纖維和韌皮薄壁細(xì)胞組成，韌皮部占橫切面比例較少。形成層不明顯。木質(zhì)部由薄壁細(xì)胞、導(dǎo)管和纖維組成，占根橫切面1/2 以上，導(dǎo)管散在、口徑較大。維管射線明顯。無髓部（圖2）。

圖2 穿根藤根橫切

1.2.3 莖橫切面顯微 類圓形。表皮角質(zhì)化明顯，為一列排列整齊的類方形細(xì)胞，具非腺毛。皮層為類圓形的薄壁細(xì)胞，皮層內(nèi)側(cè)部分細(xì)胞中含有較多的草酸鈣針晶束。維管束為無限外韌型，其外側(cè)有1~2 層石細(xì)胞群，斷續(xù)成環(huán)。韌皮部為多邊形的小型細(xì)胞，排列緊密。形成層不明顯。木質(zhì)部約占莖橫切面1/4，導(dǎo)管縱向排列。維管射線、髓射線明顯，其細(xì)胞為類橢圓形，1~2 列縱向緊密排列。中央有明顯的髓部，占比較大，約占莖橫切面1/2，由薄壁細(xì)胞組成且部分細(xì)胞內(nèi)具針晶束（圖3）。

圖3 穿根藤莖橫切面

1.2.4 葉橫切面顯微鑒別 葉橫切面表皮細(xì)胞排列緊密，類長方形。下表皮細(xì)胞比上表皮細(xì)胞大，且見較多的氣孔、孔下室及非腺毛。葉肉上表皮下方具1~2 層薄壁細(xì)胞再下方為柵欄組織細(xì)胞。柵欄組織細(xì)胞縱向排列，較短小，由2~3 層短圓柱形細(xì)胞組成，幾乎通過葉脈。海綿組織細(xì)胞明顯，排列疏松，占葉肉橫切面比例較大，易見側(cè)脈維管束。主脈上下表皮內(nèi)側(cè)有2~3 層厚角組織，中央具半月型維管束，木質(zhì)部在上方，呈馬蹄狀類圓形，導(dǎo)管放射性排列。形成層不明顯。韌皮部在下方，且緊貼其下方具3~5 層明顯的纖維細(xì)胞（圖4）。

圖4 穿根藤葉橫切面

1.2.5 粉末顯微鑒別 粉末為暗綠色。木纖維較多，成束或單個散在，兩端鈍平或尖，壁呈不均勻增厚，表面有明顯的紋孔溝，直徑10~20 μm。多見草酸鈣針晶，成束或散在，長28~35 μm。淀粉粒單?；驈?fù)粒，呈卵圓形或橢圓形，臍點(diǎn)呈點(diǎn)狀，直徑5~8 μm。導(dǎo)管有螺紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管、具緣紋孔導(dǎo)管和梯紋導(dǎo)管，直徑18~35 μm?？梢妴渭?xì)胞非腺毛，長30~55 μm。石細(xì)胞呈類方形或長方形，孔溝紋明顯；長35~52 μm，寬30~40 μm。表皮組織清晰可見；氣孔平軸式（圖5）。

1.2.6 對照品溶液制備 精密稱取車葉草苷對照品適量，加甲醇制成0.623 mg/mL 的溶液，取上清液即得。

1.2.7 供試品溶液制備 稱取本品粉末（CGT-1，過24 目篩）約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）1 h，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過蒸干，甲醇溶解定容至10 mL 容量瓶中，離心10 min（13 000 r/min）取上清液，即得供試品溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 薄層鑒別

取穿根藤對照藥材（編號CGT-1 為對照藥材）0.5 g，制成對照藥材溶液。再取車葉草苷對照品適量，加甲醇制成0.2 mg/mL 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗，吸取上述溶液各2 μL，點(diǎn)于同一硅膠Gf 薄層板上，以氯仿-甲醇-水（5-1.5-0.1）為展開劑，展開，取出晾干，噴10% 硫酸乙醇溶液，晾干，置紫外燈（254 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)（圖6）。

圖6 穿根藤藥材薄層色譜

2.2 檢查

2.2.1 水分 參照2015 年版《中國藥典》四部水分測定法（通則0832 第二法）測定水分，15 批穿根藤藥材水分為5.31%~11.20%（表2），均在12% 以下，從實際應(yīng)用的角度考慮，初步擬定穿根藤藥材水分不高于13.0%。

2.2.2 總灰分 參照2015 年版《中國藥典》四部灰分測定法（通則2302）測定總灰分，15 批穿根藤藥材總灰分為4.77%~7.06%（表2），從實際應(yīng)用的角度考慮，初步擬定穿根藤藥材總灰分不得超過8.0%。

2.2.3 酸不溶性灰分 參照2015 年版《中國藥典》四部酸不溶性灰分測定法（通則2302）測定，酸不溶性灰分為0.09%~0.87%（表2），從實際應(yīng)用的角度考慮，初步擬定穿根藤藥材酸不溶性灰分不得超過0.9%。2.2.4 醇溶性浸出物 參照2015 年版《中國藥典》四部醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法（通則2201）測定，用50% 乙醇作溶劑，15 批穿根藤藥材浸出物含量在23.88%~35.30%（表2），均在23.0% 以上，從實際應(yīng)用的角度考慮，初步擬定穿根藤藥材醇溶性浸出物含量不得少于21.0%。

表2 15 批穿根藤藥材的檢查項測定結(jié)果（n=3）

2.3 含量測定

2.3.1 色譜條件 Agilent5TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.1% 磷酸（14∶86）為流動相，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長240 nm，柱溫25 ℃，流速0.8 mL/min。對照品及供試品溶液HPLC 見圖7。

圖7 車葉草苷HPLC

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密吸取上述車葉草苷對照品溶液（0.623 g/L）1 mL，分別置于1、5、10、25、50、100 mL 容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制系列車葉草苷對照品溶液。分別吸取上述6 個濃度的溶液10 μL，按選定的色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y=5 234.1X-0.743 2，表明車葉草苷在0.006 23~0.623 g/L 與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗 取同一車葉草苷對照品溶液（0.124 6 g/L），連續(xù)進(jìn)樣6 次進(jìn)行測定，結(jié)果車葉草苷峰面積的RSD為0.99%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取穿根藤供試品溶液（CGT-1），分別于制備后0、2、4、6、8、16、24 h 進(jìn)樣10 μL 測定，結(jié)果測得車葉草苷峰面積RSD為2.05%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 稱取穿根藤藥材干燥粉末（CGT-1）0.5 g，共6 份，精密稱定，測定并計算車葉草苷的含量，RSD為2.38%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收試驗 精密稱定已知含量的穿根藤藥材干燥粉末（CGT-1）0.25 g，共6 份，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入車葉草苷對照品溶液（0.623 g/L）1.5 mL，制備供試品溶液，按色譜條件測定，測得平均加樣回收率為99.83%，RSD為2.10%，結(jié)果見表3。

表3 穿根藤中車葉草苷的加樣回收試驗

2.3.7 樣品測定 分別稱取不同批次穿根藤干燥粉末0.5 g，精密稱定，制備供試品溶液，按色譜條件測定車葉草苷含量，結(jié)果見表4。

表4 不同批次穿根藤中車葉草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）（單位：%）

3 討論

通過對多產(chǎn)地的樣品進(jìn)行觀察，壯藥穿根藤藥材性狀特征主根不明顯，莖圓柱形，莖上許多不定根，具細(xì)縱紋，葉對生，全緣，稍反卷。顯微鑒別特征為根橫切面具有明顯的木質(zhì)部，韌皮部外側(cè)部分薄壁細(xì)胞具有針晶束；莖橫切面韌皮部外側(cè)具有石細(xì)胞群，髓部明顯；葉橫切面葉肉上表皮下方具1~2 層薄壁細(xì)胞，柵欄組織和海綿組織分化明顯，主脈維管束半月形，韌皮部下方具纖維束；粉末中纖維束、石細(xì)胞、針晶等多見。薄層鑒別以氯仿-甲醇-水（5-1.5-0.1）為展開劑，展開，噴10% 硫酸乙醇溶液，置于紫外光燈（254 nm）下檢視，供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同大小和顏色的斑點(diǎn)。以上特征明顯，專屬性強(qiáng)，可作為穿根藤藥材鑒別的參考依據(jù)。

3.1 TLC 鑒別

薄層色譜研究過程中，對供試品提取條件進(jìn)行摸索。對甲醇、70% 甲醇、50% 甲醇、30% 甲醇、乙醇、70% 乙醇、50% 乙醇、30% 乙醇8 種不同極性的溶劑進(jìn)行考察，最終以甲醇提取液所得薄層色譜圖斑點(diǎn)最清晰。對冷浸12 h、超聲1 h、水浴回流1 h 3種不同提取方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，冷浸提取所得色譜圖斑點(diǎn)較淡，超聲和回流提取所得色譜圖基本一致，以超聲提取1 h 最為省時簡便。對不同點(diǎn)樣方式進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)點(diǎn)狀點(diǎn)樣方式所得薄層色譜圖斑點(diǎn)不明顯，而帶狀點(diǎn)樣方式能清晰體現(xiàn)出斑點(diǎn)，以帶狀點(diǎn)樣作為薄層點(diǎn)樣方式。還對不同展開系統(tǒng)、藥材取樣量、不同顯色劑及溫濕度進(jìn)行了考察，得出最穩(wěn)定可靠的薄層鑒別方法。

3.2 HPLC 含量測定

前期研究發(fā)現(xiàn)，從穿根藤中能檢出車葉草苷。車葉草苷具有抗菌、抗氧化，抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛等作用，這與穿根藤的功效主治具有一定相關(guān)性，故薄層鑒別中以車葉草苷為對照品，并且以車葉草苷為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定。

穿根藤中車葉草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0.019 6%~0.590 9%，大多數(shù)在0.10% 以上，其中上思縣那琴鄉(xiāng)聯(lián)惠村（CGT-2）所得含量甚少，可能因藥材存放時間過久所致；15 批穿根藤藥材中車葉草苷含量較低的多采于春季，可能與春季多采集到新長葉片與嫩莖有關(guān)；考慮到不同產(chǎn)地不同采收時間的藥材車葉草苷含量不一，建議按干燥品計算，將車葉草苷含量放寬至不少于0.10%。