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    牛大力葉中總多糖、總黃酮、總皂苷含量及其抗氧化活性的研究

    2021-11-15 07:02:40莫宏輝鄧國(guó)衛(wèi)
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年19期
    關(guān)鍵詞:吸光皂苷黃酮

    莫宏輝,鄧國(guó)衛(wèi),李 珊

    (1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院,長(zhǎng)沙 410007;2.湖南中和制藥有限公司,長(zhǎng)沙 410205)

    牛大力為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millet?tia speciosaChamp.),以根入藥,屬于藥食同源品種之一,具有補(bǔ)虛潤(rùn)肺、強(qiáng)筋活絡(luò)等功效,中醫(yī)臨床上常用于治療腰肌勞損、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、肺虛咳嗽、慢性支氣管炎等[1]。據(jù)已有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn),牛大力中存在多糖類、三萜皂苷類、黃酮類、生物堿類、微量元素、氨基酸等多種不同類型成分[2,3],具有提高免疫、抗疲勞、抗應(yīng)激、保肝、祛痰、止咳、平喘、抗氧化、抗炎、抗腫瘤等作用[4,5]。

    牛大力葉是來(lái)源于美麗崖豆藤的葉子,全年可采收,目前有關(guān)牛大力葉的研究報(bào)道主要集中于專利方面,如“一種牛大力葉或/和花保健茶及其加工方法”“一種牛大力葉茶及其制備方法”等[6,7],而對(duì)其化學(xué)成分、藥理活性、提取純化工藝等則未見報(bào)道。目前,國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)已批準(zhǔn)牛大力作為新食品原料,但在促進(jìn)該產(chǎn)業(yè)發(fā)展的同時(shí)也引發(fā)了原材料價(jià)格上漲,如能對(duì)其葉子資源進(jìn)行開發(fā)利用,將有望借鑒于枇杷葉、三七花、三七莖葉、白木香葉等作為地方特色食品成為新食品原料[8]。因此,本研究對(duì)牛大力葉中的總多糖、總黃酮、總皂苷等成分含量進(jìn)行測(cè)定,同時(shí)對(duì)其體外抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià),以期為其資源的開發(fā)利用提供試驗(yàn)依據(jù),也進(jìn)一步填補(bǔ)相關(guān)研究的空白。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試藥D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(含量98%,CAS號(hào):50-99-7,成都埃法生物科技有限公司);蘆丁對(duì)照品(含量98 %,CAS 號(hào):153-18-4,成都埃法生物科技有限公司);人參皂苷Rb1 對(duì)照品(含量98%,CAS 號(hào):41753-43-9,成都埃法生物科技有限公司);無(wú)水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、過(guò)硫酸鉀、硫酸亞鐵、過(guò)氧化氫、香草醛、水楊酸、冰醋酸、高氯酸、鄰苯三酚、苯酚、濃硫酸、鹽酸、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基,2,2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等均為分析純。

    牛大力鮮葉由湖南中和制藥有限公司提供,批次分別為01、02、03,每批次2 kg,由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院李珊副主任藥師鑒定為豆科崖豆藤屬植物美麗崖豆藤(Millettia speciosaChamp.)的葉子。1.1.2 儀器 UV-1700 雙光束紫外分光光度計(jì)(日本島津);BP-211D 電子分析天平(德國(guó)Sartorius 公司);FreeZone2.5 冷凍干燥機(jī)(美國(guó)LABCONCO);RE-52 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇金怡儀器科技有限公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 牛大力葉提取物制備[9]將不同批次牛大力葉置于烘箱60 ℃烘干,粉碎成粗粉,準(zhǔn)確稱取100 g,第一次加入20倍量水,浸泡0.5 h,加熱回流提取2 h,提取液離心,取上清液;第二次加入15 倍量水,加熱回流提取2 h,提取液離心,取上清液,轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中75 ℃減壓濃縮至適宜濃度,真空冷凍干燥后粉碎過(guò)100 目篩,測(cè)得固形物得率分別為:01 批次,16.8%;02 批次,17.3%;03 批次,16.2%。

    1.2.2 總多糖的含量測(cè)定[3,10]

    1)溶液的配制。精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品10.25 mg 于100 mL 容量瓶中,加去離子水定容,配制102.5 μg/mL 的對(duì)照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物50.13 mg 于100 mL 容量瓶中,加去離子水定容,配制501.3 μg/mL 的供試品溶液。

    2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取102.5 μg/mL 的D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL到試管中,依次加入水1.8、1.6、1.4、1.2、1.0 mL,再分別加入5% 苯酚溶液1.0 mL 和濃硫酸溶液5.0 mL,80 ℃水浴20 min,取適量混合液于分光光度計(jì)中490 nm 處測(cè)定吸光值。以D-無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度為X、吸光度值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算線性回歸方程:Y=0.084 0X+0.031 7(R2=0.996 8),結(jié)果顯示,在2.56~12.81 μg/mL,吸光值具有良好的線性關(guān)系。

    3)方法學(xué)考察。參考文獻(xiàn)[3]和[10]操作,測(cè)得精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為1.03%、0.82%、0.59%、1.06%,表明該方法及儀器均符合要求(回收率具體數(shù)據(jù)見表1)。

    4)總多糖含量測(cè)定。按照以上試驗(yàn)操作步驟同法測(cè)定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光值,計(jì)算總多糖含量。

    1.2.3 總黃酮的含量測(cè)定[3,11]

    1)溶液的配制。精密稱取蘆丁對(duì)照品9.80 mg于10 mL 容量瓶中,加60% 乙醇定容,配制0.98 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物100.13 mg 于10 mL 容量瓶中,加60% 乙醇定容,配制10.013 mg/mL 的供試品溶液。

    2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.98 mg/mL 的蘆丁對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到試管中,各加入0.5 mL 的5% 亞硝酸鈉溶液,混勻,靜置6 min,再加入0.5 mL 的5% 硝酸鋁溶液,混勻,靜置6 min,然后加入4.0 mL 的4% 氫氧化鈉溶液,最后加入60% 乙醇定容至10 mL,靜置15 min,取適量混合液于分光光度計(jì)中510 nm 處測(cè)定吸光值。以蘆丁質(zhì)量濃度為X、吸光值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程:Y=0.008 2X+0.020 5(R2=0.998 8),結(jié)果顯示,在19.60~98.0 μg/mL,吸光值具有良好的線性關(guān)系。

    3)方法學(xué)考察。參考文獻(xiàn)[3]和[11]操作,測(cè)得精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為1.10%、2.41%、1.98%、1.03%,表明該方法及儀器均符合要求(回收率具體數(shù)據(jù)見表2)。

    4)總黃酮含量測(cè)定。按照以上試驗(yàn)操作步驟同法測(cè)定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光度值,計(jì)算總黃酮含量。

    1.2.4 總皂苷的含量測(cè)定[3,12]

    1)溶液的配制。精密稱取人參皂苷Rb1 對(duì)照品8.20 mg 于10 mL 容量瓶中,加甲醇定容,配制0.82 mg/mL 的對(duì)照品溶液。精密稱取01 批次牛大力葉提取物150.24 mg 于10 mL 容量瓶中,加甲醇定容,配制15.024 mg/mL 的供試品溶液。

    2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別吸取0.82 mg/mL 的人參皂苷Rb1 對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 到試管中,水浴蒸干后加入0.2 mL 的5 %香草醛冰醋酸試液和0.8 mL 高氯酸,60 ℃水浴20 min,取出加入5.0 mL 冰醋酸,混勻后取適量混合液于分光光度計(jì)中540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值,以人參皂苷Rb1 質(zhì)量濃度為X、吸光值為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程:Y=0.003 8X+0.160 4(R2=0.999 1),結(jié)果顯示,在27.0~135.0 μg/mL,吸光值具有良好的線性關(guān)系。

    3)方法學(xué)考察。參考文獻(xiàn)[3]和[12]操作,測(cè)得精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、加樣回收率試驗(yàn)的RSD分別為0.67%、3.95%、4.27%、3.16%,表明該方法及儀器均符合要求(回收率具體數(shù)據(jù)見表3)。

    4)總皂苷含量測(cè)定。按照以上試驗(yàn)操作步驟同法測(cè)定02 批次、03 批次牛大力葉供試品溶液吸光度值,計(jì)算總皂苷含量。

    1.2.5 清除DPPH·能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13],分別吸取2 mL 的01 批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液(5.0~30.0 mg/mL)、1.0 mL 0.35 mg/mL 的DPPH儲(chǔ)備液加入到試管中,反應(yīng)30 min 后取適量混合液于分光光度計(jì)中517 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)m;另吸取2 mL 水和1 mL 的DPPH 儲(chǔ)備液,同法反應(yīng)后測(cè)定吸光值A(chǔ)0;另吸取牛大力葉提取物溶液2 mL 和無(wú)水乙醇1.0 mL,同法反應(yīng)后測(cè)定吸光值A(chǔ)n。根據(jù)公式計(jì)算其清除率:

    1.2.6 清除ABTS+·能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13],按照體積比2∶1,分別吸取7 mmol/L 的ABTS 溶液和7.35 mmol/L 的過(guò)硫酸鉀溶液適量進(jìn)行混合,避光反應(yīng)16 h,再用水稀釋,取適量混合液于分光光度計(jì)中734 nm 處測(cè)定,調(diào)節(jié)至吸光值A(chǔ)0為0.70±0.2。再分別吸取01 批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液(1.0~10.0 mg/mL)2 mL 和ABTS 稀釋液4 mL 加入試管中,超聲30 s,靜置反應(yīng)8 min 后同法測(cè)定吸光值A(chǔ)1。根據(jù)公式計(jì)算其清除率:

    1.2.7 清除·OH 能力測(cè)定 參考文獻(xiàn)[13],吸取01批次不同質(zhì)量濃度牛大力葉提取物溶液(4.0~14.0 mg/mL)、6 mmol/L 的FeSO4溶液、6 mmol/L 的H2O2溶液各2 mL 加入到試管中,反應(yīng)10 min 后加入6 mmol/L 的水楊酸溶液2 mL,反應(yīng)30 min,取適量混合液于分光光度計(jì)中510 nm 處測(cè)定吸光值A(chǔ)1;以水代替水楊酸溶液,同法操作后測(cè)定吸光值A(chǔ)2;另外以純水作為空白對(duì)照,同法操作后測(cè)定吸光值A(chǔ)0。根據(jù)公式計(jì)算其清除率:

    2 結(jié)果與分析

    2.1 方法學(xué)考察結(jié)果

    3 種不同類型成分測(cè)定方法的加樣回收率試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表1(樣品取樣量為501.30 μg,樣品中多糖量為40.60 μg,加入對(duì)照品量為41.00 μg)、表2(樣品取樣量為10 013.00 μg,樣品中黃酮量為360.98 μg,加入對(duì)照品量為343.00 μg)和表3(樣品取樣量為15 024.00 μg,樣品中皂苷量為137.79 μg,加入對(duì)照品量為123.00 μg),結(jié)果均表明所用方法的準(zhǔn)確性良好,能夠有效進(jìn)行含量測(cè)定。

    表1 牛大力葉提取物總多糖加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

    表2 牛大力葉提取物總黃酮加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

    表3 牛大力葉提取物總皂苷回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)

    2.2 不同類型成分含量的測(cè)定

    由試驗(yàn)分別測(cè)得牛大力葉提取物中總多糖、總黃酮、總皂苷的含量依次為(1.36±0.05)% 、(0.61±0.007)%、(0.15±0.013)%,其中以總多糖含量最高、總皂苷含量最低,結(jié)果見表4。

    表4 牛大力葉提取物中不同類型成分的含量(n=3)(單位:%)

    2.3 體外抗氧化能力評(píng)價(jià)

    由試驗(yàn)分別測(cè)得牛大力葉提取物對(duì)不同自由基清除能力變化趨勢(shì)的線性回歸方程及IC50,其中IC50由小到大依次為ABTS+·、O-2·、·OH、DPPH·,結(jié)果見表5、圖1。

    表5 牛大力葉提取物對(duì)不同自由基的清除能力

    圖1 不同濃度牛大力葉提取物對(duì)不同自由基的清除率

    3 小結(jié)

    試驗(yàn)通過(guò)水提法制備牛大力葉提取物,以化學(xué)顯色法及分光光度法測(cè)定不同類型成分的含量,發(fā)現(xiàn)其含量高低排序?yàn)榭偠嗵?總黃酮>總皂苷,這與其牛大力根所測(cè)得成分含量高低趨勢(shì)基本一致[3],說(shuō)明同株植物不同部位的成分類型及含量高低具有一定的相似性。同時(shí),體外抗氧化試驗(yàn)結(jié)果顯示,牛大力葉提取物對(duì)ABTS+·的抗氧化能力最強(qiáng),而對(duì)DPPH·的清除能力則最弱。與已報(bào)道的相比,與黃精多糖等效果接近而比白芷多糖、合歡皮多糖、車前子多糖等更強(qiáng)[14]。

    因此,可在此牛大力葉提取物的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步利用醇沉、柱層析、有機(jī)溶劑萃取等方法進(jìn)行純化、分離、富集,以獲得成分純度和含量更高、抗氧化活性更強(qiáng)的物質(zhì),為牛大力葉的相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)依據(jù)。有關(guān)抗氧化作用強(qiáng)弱與不同類型成分間的相關(guān)性,將在進(jìn)一步的試驗(yàn)中展開研究。

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