牡丹不同木質(zhì)化程度枝條的紅外光譜分析

李秀麗，陳 鎮(zhèn)，戢小梅，戴志剛，陳法志，陳志偉，翟敬華

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所，武漢 430075；2.湖北省耕地質(zhì)量與肥料工作總站，武漢 430070）

牡丹（Paeonia suffruticosaAndr.）原產(chǎn)中國(guó)，屬多年生落葉灌木，因極具觀賞和藥用價(jià)值而被人們熟知，目前已有2 000 多年的栽培歷史［1，2］。近幾年研究發(fā)現(xiàn)鳳丹白（Paeonia ostii‘Fengdanbai’）籽仁中含油率較高，在22% 以上，高于國(guó)產(chǎn)大豆的含油率（17.5%）。牡丹籽油中富含氨基酸、蛋白質(zhì)、多糖、類胡蘿卜素、微量元素及維生素群和多種不飽和脂肪酸，尤其是α-亞麻酸的含量超過42.35%，被稱為液體黃金［3］。2011 年國(guó)家衛(wèi)生部批準(zhǔn)牡丹籽油為一種非傳統(tǒng)新植物油資源，在國(guó)內(nèi)外掀起一股牡丹熱，中國(guó)牡丹也將以油用牡丹的角色再次進(jìn)入一個(gè)繁榮發(fā)展的歷史時(shí)期。牡丹在生長(zhǎng)和栽培中存在以下特征和問題：一，牡丹的生長(zhǎng)不同于其他植物，存在“長(zhǎng)一尺退八寸”的“退枝”現(xiàn)象。牡丹由多種木質(zhì)化程度不同的枝條組成，包括木質(zhì)化程度較高的多年生枝條、木質(zhì)化程度次之的一年生新枝下部及木質(zhì)化程度最低的一年生新枝上部，新枝上部因木質(zhì)化程度低，耐寒性較差，冬季便自行枯死，僅剩一年生枝條的下半部越冬，這一部分才是牡丹枝條長(zhǎng)度當(dāng)年的實(shí)際生長(zhǎng)量，僅為當(dāng)年生長(zhǎng)量的1/4~1/3，被稱為“退枝”。二，高溫是限制牡丹生長(zhǎng)的重要環(huán)境因素，隨著高溫時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片出現(xiàn)失綠、黃化、焦枯、提早落葉，直至植株死亡。在中國(guó)本地，存在著一些較能適應(yīng)高溫的品種，如鳳丹白，卻仍然避免不了高溫引起的生育期短、落花落果等現(xiàn)象的發(fā)生，嚴(yán)重阻礙了牡丹在長(zhǎng)江中下游及以南地區(qū)的推廣種植［4，5］。三，牡丹傳統(tǒng)繁殖方法以播種、嫁接和分株為主，存在遺傳性狀不穩(wěn)定和繁殖效率低的現(xiàn)象，無法滿足市場(chǎng)需求。研究人員嘗試通過扦插來提高牡丹的繁殖效率，但扦插效果有待提高［6］。值得注意的是，越來越多的研究顯示，植物的生長(zhǎng)特性與栽培中存在的問題與枝條的木質(zhì)化程度息息相關(guān)，尤其是植物的耐熱性和扦插效果等［6-8］。然而，有關(guān)牡丹枝條木質(zhì)化方面的系統(tǒng)研究鮮有報(bào)道，本研究將從光譜學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)角度入手，解析不同木質(zhì)化程度枝條的化學(xué)成分基礎(chǔ)，深入解析牡丹的生長(zhǎng)特性，并為提高牡丹抗性和扦插效果奠定理論基礎(chǔ)。

FTIR（Fourier Transformation Infrared Spectrosco?py，F(xiàn)TIR）光譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可以通過特征振動(dòng)峰進(jìn)行物質(zhì)鑒定，是近年來廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)材料上的一種新型光譜手段，可快速準(zhǔn)確地分析農(nóng)業(yè)材料（如花粉、植物油、中藥、木材）的物質(zhì)成分［9-13］。此外，借助FTIR，還可對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)［9］、蛋白質(zhì)反應(yīng)的分子機(jī)制［14］和蛋白質(zhì)的折疊［15］進(jìn)行系統(tǒng)的分析。FTIR 圖譜中氨基Ⅰ的振動(dòng)在1 650 cm-1附近，主要來源于C=O 的伸縮振動(dòng)及少量的CN 面外彎曲振動(dòng)、CCN 變形振動(dòng)和NH 的面內(nèi)彎曲振動(dòng)［16］。氨基Ⅰ振動(dòng)峰的強(qiáng)度和峰型與蛋白質(zhì)的骨架結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，而與蛋白質(zhì)的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)關(guān)系不大，即主要取決于蛋白質(zhì)主鏈上的二級(jí)結(jié)構(gòu)［17］。因此，一般選用氨基Ⅰ區(qū)域的振動(dòng)峰進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析。本研究的目的是通過FTIR 技術(shù)分析比較牡丹不同木質(zhì)化程度枝條中物質(zhì)成分的差別及變化規(guī)律，并通過高斯多峰擬合從蛋白質(zhì)化學(xué)角度分析各組織內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分布特點(diǎn)及變化趨勢(shì)，為其他相關(guān)研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

4 年生鳳丹白苗購(gòu)買于山東省菏澤市，2015 年10 月以大田栽植的方式種植于武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林果所牡丹資源圃，種植密度為40 cm×80 cm。并根據(jù)牡丹苗生長(zhǎng)情況統(tǒng)一進(jìn)行澆水、施肥、除草以及病蟲害防治管理。

1.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）表征

切取新鮮的鳳丹牡丹的莖和葉柄，先后用清水和去離子水（>18 MΩ）清洗，將清洗干凈的牡丹植株器官（莖和葉柄）鮮樣切碎后，置于110 ℃殺青1 h，75 ℃烘干至恒重。然后用球磨儀將樣品粉碎成粉末（粒徑小于2 μm）。采用KBr 壓片法，即取1~2 mg干燥的樣品與200 mg 干燥的KBr 研成均一細(xì)粉（粒徑小于2 μm），以免散射光影響。底模裝入模膛，往模心中加入少量樣品，用藥匙將模具中的樣品刮平，并使其中心略高，將頂模放入模心，用（5~10）×107Pa壓力在液壓機(jī)上壓成透明薄片（1~2 min），將KBr 壓片夾放入紅外光譜儀中（Bruker vertex 70）的透射配件中，以KBr 空白片（或空氣）為參比，選用4 cm-1的分辨率，掃描128 次；波數(shù)范圍4 000~400 cm-1［18］。

1.3 數(shù)據(jù)擬合及分析

借助Origin 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)FTIR 原始數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，選取氨基I 區(qū)域（1 700~1 600 cm-1）的曲線并對(duì)其進(jìn)行高斯單峰正態(tài)分布的曲線擬合，再根據(jù)不同蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的FTIR 峰位，對(duì)擬合曲線再次進(jìn)行高斯多峰擬合，具體分峰數(shù)依據(jù)結(jié)果而定。

2 結(jié)果與分析

2.1 鳳丹白枝條的發(fā)育特點(diǎn)

鳳丹白為落葉灌木，莖干直立，分支短而粗壯（圖1a）。根據(jù)木質(zhì)化程度不同，依次為：木質(zhì)化程度最高的多年生枝條（枝條1），枝皮為褐灰色，有縱紋（圖1b）；木質(zhì)化程度次之的枝條，位于葉腋內(nèi)有芽點(diǎn)（頂芽）的一年生枝條下部（圖1b 和圖1c），枝皮為淺黃綠色，稱之為木質(zhì)化程度較高的一年生枝條（枝條2）（圖1b）；木質(zhì)化程度最低的枝條主要是指葉腋內(nèi)無芽點(diǎn)的一年生枝條上部（圖1b 和圖1c），將其定義為木質(zhì)化程度較低的一年生枝條（枝條3）（圖1c）。從枝條1 到枝條3 木質(zhì)化程度逐漸降低。

圖1 不同類型枝條的界定

2.2 枝條的FTIR 特征

和標(biāo)準(zhǔn)歸屬詳見表1。結(jié)合圖2 和表1 可以看出，不同木質(zhì)化程度枝條的FTIR 特征峰差異較大，也存在一定的規(guī)律性，比如778 和3 420 cm-1處的特征峰隨木質(zhì)化程度的增加而逐漸減弱。778 cm-1特征峰是由于C-C 伸縮振動(dòng)引起，屬于碳水化合物［19］，表明枝條中碳水化合物的含量隨木質(zhì)化程度的增加而降低；3 420 cm-1處的特征峰歸屬于OH 伸縮振動(dòng)，主要源于組織中脂肪酸、各種碳水化合物（果膠、半纖維

圖2 枝條的FTIR 圖譜的比較

表1 枝條FTIR 圖譜的主要峰位及其歸屬

圖2 表明，鳳丹白不同類型的枝條從4 000 cm-1到400 cm-1共存在12 個(gè)特征峰，其對(duì)應(yīng)的振動(dòng)頻率素、多糖）等對(duì)光譜的貢獻(xiàn)［20］。1 253、1 385、1 461 和1 738 cm-1處特征峰的振動(dòng)強(qiáng)度隨木質(zhì)化程度的增加而逐漸增強(qiáng)。1 253 和1 738 cm-1處特征峰分別對(duì)應(yīng)磷脂質(zhì)和核酸的P=O 對(duì)稱伸縮振動(dòng)［21］以及磷脂質(zhì)和油脂的C=O 伸縮振動(dòng)［22］；1 385 cm-1處的特征峰代表CH3和CH2的對(duì)稱變形彎曲振動(dòng)，主要來源于蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和木質(zhì)素［21］；1 461 cm-1為蛋白質(zhì)、脂類和木質(zhì)素的CH3和CH2反對(duì)稱變形彎曲振動(dòng)［21，22］，可見木質(zhì)化程度高的枝條中含有更多的木質(zhì)素成分。1 043 cm-1特征峰的峰位在枝條1 到枝條3 的過程中分別發(fā)生了藍(lán)移，枝條1 中1 043 cm-1處振動(dòng)峰，枝條2 和3 中，變?yōu)? 053 cm-1，此區(qū)域峰位對(duì)應(yīng)細(xì)胞壁多糖COH 變形振動(dòng)或C-O 伸縮振動(dòng)［22，23］。表明鳳丹白枝條1 的細(xì)胞壁多糖以葡甘露聚糖為主，而枝條3 的細(xì)胞壁多糖以阿拉伯聚糖為主。枝條1 和2中1 426 cm-1特征峰在枝條3 中移動(dòng)至1 410 cm-1。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道1 450~1 410 cm-1屬于果膠或氨基酸COO-的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰［22，24］。此外，1 511 cm-1處特征峰屬于氨基II 的N-H 伸縮振動(dòng)［25］，該峰峰強(qiáng)隨木質(zhì)化程度的降低而減弱，枝條3 中則不存在此峰。1 636 cm-1為氨基I 的C=O 伸縮振動(dòng)和NH 彎曲振動(dòng)，與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)［22］，其他特征峰無明顯變化趨勢(shì)。

2.3 不同種類枝條的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特性

為了進(jìn)一步分析鳳丹白不同類型枝條中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的特征及其差異性，對(duì)1 700~1 600 cm-1處的紅外吸收峰進(jìn)行詳細(xì)分析。首先對(duì)1 700~1 600 cm-1的原始譜圖（圖3 中黑色實(shí)線）進(jìn)行高斯單峰擬合，擬合方程為：

不同枝條中擬合方程的具體參數(shù)見表2，高斯單峰擬合曲線如圖3 中黑色實(shí)線。

表2 枝條中氨基I（1 700~1 600 cm-1）區(qū)域的擬合參數(shù)

根據(jù)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的峰位（表3 所示），再對(duì)擬合單峰（圖3 中紅色實(shí)線）進(jìn)行高斯多峰擬合［9］。1 700~1 600 cm-1存在5 種蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，波數(shù)從低到高為：β+S+P、β、α、L+T 和β+T，其中L、T、α、β、S 和P 分別代表環(huán)（loop）、轉(zhuǎn)角（turn）、α-螺旋（αhelix）、β-折疊（β-sheet）側(cè)鏈（side chain）和果膠（pectin）（圖3）。枝條1、枝條2 和枝條3 中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的種類及其比例如圖4 所示，對(duì)于同一組織而言，牡丹枝條1 中蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)β +S+P（36.69%）>β（25.78%）>α（20.96%）>L+T（14.31%）>β +T（2.26%）；牡丹枝條2 中β +S+P（44.11%）>α（30.37%）>β（12.81%）>L+T（12.71%）>β+T（0%）；牡丹枝條3 中β+S+P（40.41%）>α（29.35%）>β（17.15%）>L+T（13.09%）>β+T（0%）。對(duì)于同一種蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)而言，β+S+P：枝條2>枝條3>枝條1；β：枝條1>枝條3>枝條2；α：枝條2>枝條3>枝條1；L+T：枝條1>枝條3>枝條2；β+T：枝條1>枝條2=枝條3；牡丹不同類型的枝條中所含蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的共同點(diǎn)是α和β 結(jié)構(gòu)所占比例之和所占比例最多（43%~47%），其次是β+S+P（36%~45%），再次是L+T（10%~15%），最少為β+T 的二級(jí)結(jié)構(gòu)（0%~3%）。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)所占比例與枝條的木質(zhì)化程度存在一定關(guān)系：隨著木質(zhì)化程度的降低（枝條1 到枝條2，再到枝條3），β+S+P 和α 均出現(xiàn)先增加后平穩(wěn)的趨勢(shì)；β 呈先降低后平穩(wěn)的趨勢(shì)；L+T 變化較為平穩(wěn)。

表3 用于曲線擬合的枝條中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)及波數(shù)

圖4 基于高斯多峰擬合分析枝條內(nèi)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的百分比

3 小結(jié)與討論

牡丹的枝條按木質(zhì)化程度不同，包括木質(zhì)化程度最高的多年生枝條（枝條1）、木質(zhì)化程度較高的一年生枝條（枝條2）、木質(zhì)化程度較低的一年生枝條（枝條3）（圖1）。前人主要關(guān)注牡丹的莖結(jié)構(gòu)與抗寒性關(guān)系以及不同發(fā)育時(shí)期莖中糖類物質(zhì)的變化［26，27］。本研究借助FTIR 技術(shù)和高斯擬合分析方法重點(diǎn)研究枝條木質(zhì)化程度與化學(xué)成分和分子構(gòu)象的關(guān)系，從光譜學(xué)和蛋白質(zhì)化學(xué)角度為解析牡丹枝條木質(zhì)化程度的差異性提供理論基礎(chǔ)。

3.1 FTIR 解析鳳丹白不同木質(zhì)化程度枝條的化學(xué)成分特性

FTIR 通過分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)引起的偶極矩變化鑒定化合物的分子結(jié)構(gòu)，也可用于物質(zhì)的定量分析［28］。Lakshmi［29］利用FTIR 對(duì)防風(fēng)草葉片中多種化合物進(jìn)行了鑒定；Lahlali 等［9］借助FTIR 揭示了熱脅迫下豌豆花粉粒中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的變化規(guī)律；Chatjigakis 等［30］通過FTIR 技術(shù)研究了桃細(xì)胞壁上果膠的酯化程度。而本研究借助FTIR 技術(shù)詳細(xì)分析了不同類型枝條中特征化合物的種類及其變化規(guī)律，結(jié)果表明不同木質(zhì)化程度的枝條在物質(zhì)成分上存在較大差別。枝條1 的木質(zhì)化程度高，所以木質(zhì)素含量較其它類型枝條高（1 385 和1 461 cm-1）（圖2）。一年生枝條細(xì)胞分裂較快，單個(gè)植物細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中其體積可膨脹大約20 000 倍，因此細(xì)胞壁必須均勻協(xié)同生長(zhǎng)，才能保持結(jié)構(gòu)的完整性，以維持足夠的強(qiáng)度抵抗來自胞內(nèi)5 個(gè)大氣壓的壓力并防止由于細(xì)胞壁局部缺陷造成的細(xì)胞“大出血”（細(xì)胞質(zhì)外滲）［31，32］。細(xì)胞壁的主要組分包括纖維素、半纖維素和果膠［33］。纖維素在不同類型枝條中的含量變化不大，而與果膠相關(guān)的特征峰強(qiáng)度（3 420 cm-1）（表1）在一年生枝條中逐漸增強(qiáng)，且果膠的另一特征峰（1 410~1 450 cm-1）從枝條1 到枝條3 中發(fā)生紅移現(xiàn)象（表1），主要是因?yàn)楣z中COO-以單齒絡(luò)合方式與金屬離子結(jié)合時(shí)，其振動(dòng)頻率將顯著低于游離的COO-［34］，因此，推測(cè)枝條3 細(xì)胞壁中果膠以單齒絡(luò)合的形式與金屬離子（如Ca2+）結(jié)合，從而促進(jìn)細(xì)胞壁的有序自組裝，確保細(xì)胞壁的剛性和完整性。

3.2 枝條木質(zhì)化程度與蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的關(guān)系

植物體內(nèi)行使調(diào)節(jié)功能的往往是蛋白質(zhì)，為了進(jìn)一步理解不同木質(zhì)化程度枝條的蛋白質(zhì)基礎(chǔ)，本研究對(duì)3 種類型枝條分別進(jìn)行了氨基Ⅰ區(qū)域的曲線擬合分析，詳細(xì)調(diào)查不同類型枝條蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的差異。總體來說，不同木質(zhì)化程度的枝條均含有多種不同的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4）。β-折疊+側(cè)鏈+果膠在枝條2 和3 中含量高于枝條1（圖4）。結(jié)合上述分析可知，木質(zhì)化程度最低的枝條3 需要更多的果膠維持細(xì)胞快速分裂時(shí)細(xì)胞壁的完整性，推測(cè)與果膠相連的β-折疊結(jié)構(gòu)能調(diào)控果膠在細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的自組裝過程。除此之外，α-螺旋在一年生枝條中的含量也高于多年生枝條（圖4），Lahlali 等［9］指出經(jīng)高溫脅迫的豌豆花粉粒，其α-螺旋出現(xiàn)顯著下降，Wolkers 等［35］發(fā)現(xiàn)當(dāng)香蒲花粉粒受到高溫脅迫時(shí)，α-螺旋也出現(xiàn)下降趨勢(shì)，這些研究提出降低α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量可以彌補(bǔ)因高溫引起的蛋白質(zhì)-水之間氫鍵減少而造成的危害，從而抑制失水對(duì)植物造成的危害。據(jù)此推測(cè)，木質(zhì)化程度高的多年生枝條1 比一年生枝條蛋白質(zhì)α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量少，是由于枝條木質(zhì)化升高后，細(xì)胞所含水分減少，蛋白質(zhì)-水之間的氫鍵也隨之減少，鳳丹白主動(dòng)調(diào)控降低蛋白質(zhì)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量，減少木質(zhì)化組織中因氫鍵缺失而對(duì)植株造成的危害。另外當(dāng)體內(nèi)的ATP（Adenosine Triphosphate，三磷酸腺苷）被修飾后（如ATP 與核酸反應(yīng)），其結(jié)合能的改變會(huì)引起蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)構(gòu)象的改變，如β-折疊和轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)會(huì)減少［36］。本研究發(fā)現(xiàn)枝條1 中β-折疊和轉(zhuǎn)角的二級(jí)結(jié)構(gòu)較當(dāng)年生新枝高，可以推測(cè)在木質(zhì)化程度高的枝條中ATP 主要是以游離態(tài)存在，為植物生長(zhǎng)提供能量基礎(chǔ)；而木質(zhì)化程度較低的一年生新枝則利用ATP 進(jìn)行物質(zhì)代謝，為株系生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

鳳丹白枝條由多年生枝條（枝條1）和一年生枝條組成，一年生新枝又以頂芽為界分為木質(zhì)化程度較高的下部枝條（枝條2）和木質(zhì)化程度較低的上部枝條（枝條3）。枝條1 中含有較多的木質(zhì)素，枝條2和3 細(xì)胞壁中含有較多的果膠，尤其是枝條3 中果膠上的羧基以單齒絡(luò)合方式與金屬離子結(jié)合，且存在許多與果膠相連的蛋白質(zhì)，有助于植株主動(dòng)調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)分裂時(shí)細(xì)胞壁的重新構(gòu)建過程。枝條1 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量較少，可以有效降低多年生枝條木質(zhì)化組織中因蛋白質(zhì)-水之間的氫鍵缺失而對(duì)植株造成的危害；枝條1 中含有較高的β-折疊和轉(zhuǎn)角，表明木質(zhì)化程度高的多年生枝條中ATP主要是以游離態(tài)存在，可為植物生長(zhǎng)提供能量基礎(chǔ)；枝條2 和枝條3 的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有較少的β-折疊和轉(zhuǎn)角，表明木質(zhì)化程度低的枝條中ATP 已被修飾，利用ATP 合成了株系生長(zhǎng)所需的物質(zhì)，為植株生長(zhǎng)提供物質(zhì)基礎(chǔ)。