液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定黑魚中氧氟沙星殘留量的不確定度評定

黃璐瑤 李澍才 李道霞 魏宇濤 余曉琴

四川省食品檢驗(yàn)研究檢測院 四川成都 610097

黑魚，學(xué)名烏鱧，屬鱸形目、鱧科，又名烏魚、才魚等，是生長快、分布廣、產(chǎn)量大的淡水名貴經(jīng)濟(jì)魚類[1]。喹諾酮類化合物是一類具有1,4-二氫-4-氧吡啶-3-羧酸結(jié)構(gòu)的人工合成抗生素[2]，可作用于DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶進(jìn)而干擾DNA復(fù)制，導(dǎo)致染色體受損，對多種革蘭氏陰性菌和陽性菌均有明顯抑制作用[3～5]。因其具有快速殺菌、抗菌譜廣、組織滲透性強(qiáng)、高效低毒、價格低廉、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性等特點(diǎn)[6～9]，廣泛應(yīng)用于人類和動物感染性疾病的防治工作[10，11]。氧氟沙星屬于第三代喹諾酮類藥物，曾在畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中用于預(yù)防和治療畜禽的細(xì)菌性感染及支原體病，具有良好效果[12，13]。但由于藥物本身特性及濫用藥物現(xiàn)象的存在，導(dǎo)致喹諾酮類化合物及其代謝物在受體動物中殘留、蓄積，并通過食物鏈富集最終進(jìn)入人體，引起食用者腸道菌群失衡或產(chǎn)生遠(yuǎn)期毒性作用及潛在“三致”(致畸、致癌、致突變)作用[14，15]。因此喹諾酮類化合物殘留問題越來越引起人們重視。目前中國、美國、歐盟等國家及聯(lián)合國糧農(nóng)組織等均已對喹諾酮類化合物的使用及限量做出明確規(guī)定。我國農(nóng)業(yè)部公告第2292號[16]中規(guī)定停止生產(chǎn)、使用包括氧氟沙星在內(nèi)的4種喹諾酮類化合物原藥、酯及其制劑。

測量不確定度，簡稱不確定度，是根據(jù)所用到的信息，表征賦予被測量值分散性的非負(fù)參數(shù)[17]，是衡量測定結(jié)果準(zhǔn)確性和可靠性的重要參數(shù)[18]。不確定度數(shù)值直接反映檢測質(zhì)量高低，是判定檢測結(jié)果可靠性的重要參考依據(jù)。由被測量值和被測量值分散性的值(即不確定度)組成的定量分析結(jié)果，既增加檢測方法和結(jié)構(gòu)的可信度，又便于比對不同實(shí)驗(yàn)室的分析結(jié)果，是食品檢驗(yàn)工作不可或缺的一部分[19，20]。RB/T 216-2017《檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)資質(zhì)認(rèn)定能力評價食品復(fù)檢機(jī)構(gòu)要求》[21]亦規(guī)定了食品復(fù)檢結(jié)果應(yīng)包括測量不確定度。

本研究參考農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[22]，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，以D5-諾氟沙星為內(nèi)標(biāo)對魚肉中氧氟沙星殘留量進(jìn)行測定，并根據(jù)JJF 1059.1-2012《不確定度評定與表示》[17]、CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[23]、JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[24]等測量不確定度的方法，建立數(shù)學(xué)模型，分析實(shí)驗(yàn)過程中的不確定度來源及各分量對測定結(jié)果的影響，對其進(jìn)行不確定度評定。內(nèi)標(biāo)法常用于樣品中低含量化合物的定量分析，在一定程度上可消除前處理操作、色譜條件微小變化等帶來的誤差及基質(zhì)效應(yīng)干擾，可有效提高定量的準(zhǔn)確性，同時起到質(zhì)量控制作用。本研究為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制及其他類似測定的正確評價，提供科學(xué)可靠的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀1260/6460，美國安捷倫科技有限公司；

電子天平XS105DU，梅特勒-托利多公司；

高速離心機(jī)HERAEUS MULTIFUGE X3R，美國Thermo Fisher Scientific公司；

渦旋混合儀IKA?MS 3，德國IKA公司。

1.2 樣品與試劑

陰性/陽性黑魚樣品；

氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.3%，批號：B0004971，北京曼哈格生物科技有限公司)；

D5-諾氟沙星(純度99.2%，批號：272238，WITEGA Laboratorien Berlin-Adlershof GmbH)；

甲醇、乙腈、乙酸銨、甲酸(色譜純，美國Fisher Chemical公司)；

無水硫酸鈉(分析純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品前處理

參考農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008[22]進(jìn)行。即精密稱取粉碎混勻陽性黑魚樣品約5g，置50mL聚丙烯離心管中，加入60μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，渦旋混合30s，避光放置10min。加入10g無水硫酸鈉，渦旋混勻，再加入20mL1%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻1min，超聲提取10min，8 000r/min離心5min，將上清液收集置50mL離心管中；殘?jiān)尤?0mL1%甲酸-乙腈溶液，重復(fù)提取一次，合并2次提取液。加入10mL乙腈飽和正己烷，渦旋1min，靜置分層，棄去上層正己烷。重復(fù)上述步驟一次，乙腈層于40℃下氮吹至近干，精密加入2mL 0.1%甲酸-乙腈(9-1，V/V)溶液渦旋使殘?jiān)芙?，過0.22μm濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密稱取11.36mg氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品置于10mL容量瓶中，加0.2mL甲酸溶解，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密吸取上述標(biāo)準(zhǔn)儲備液90μL置于10mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密稱取D5-諾氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品11.72mg置于100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得內(nèi)標(biāo)儲備液。精密量取上述內(nèi)標(biāo)儲備液1mL置于100mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備

取粉碎混勻陰性黑魚樣品(5g/份)，按樣品前處理制備空白基質(zhì)。分別精密加入上述混合標(biāo)準(zhǔn)工作液4、10、20、40、100、200μL和內(nèi)標(biāo)工作溶液30μL，氮吹至干后，精密加入1mL空白基質(zhì)充分溶解，即得標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：ACE Excel 2 Super C18(2μm,2.1×75mm)。

流速：0.25mL/min。

柱溫：35℃。

進(jìn)樣量：2μL。

梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧(ESI)，采用正離子模式。

毛細(xì)管電壓：4.0kV。

離子源溫度：320℃。

去溶劑溫度：300℃。

錐孔氣流(N2)流速：7L/min。

去溶劑氣流(N2)流速：7L/min。

碰撞氣壓：20psi。

監(jiān)測模式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring，MRM)。

其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometric parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用美國Agilent Technologies Inc.的Mass Hunter Workstation Sorfware 06.00軟件進(jìn)行分析處理，Microsoft Office Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型的建立

根據(jù)農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008[22]，并參考CNAS-GL006：2019《化學(xué)分析中不確定度的評估指南》[23]，測定魚肉中氧氟沙星含量(μg/kg)，可表示為公式(1)。

(1)

式中：X—樣品中氧氟沙星殘留量(μg/kg)；

c—標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得到樣品溶液中氧氟沙星濃度(ng/mL)；

n—稀釋倍數(shù)；

m—樣品稱樣量(g)。

2.2 不確定度來源分析

根據(jù)樣品前處理、檢測過程及對數(shù)學(xué)模型的分析[25～28]，影響魚肉中氧氟沙星殘留量測定的不確定度因素有：A類不確定度，來源包括標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合urel(A1)、測量重復(fù)性urel(A2)、方法回收率urel(A3)；B類不確定度，來源包括標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制urel(B1)、樣品前處理urel(B2)、儀器測定urel(B3)。

2.2.1 A類不確定度評估

2.2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度urel(A1)

本研究采用內(nèi)標(biāo)法定量。對標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測定，以氧氟沙星與內(nèi)標(biāo)D5-諾氟沙星濃度比值為橫坐標(biāo)，峰面積比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.120895X-0.015397。標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度源于標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差的標(biāo)準(zhǔn)偏差SR，計(jì)算公式(2)。

(2)

其中Y為實(shí)測各標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)氧氟沙星峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值，Y'為標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合氧氟沙星峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值。殘差為Y和Y' 之差的絕對值|Y-Y' |。氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差計(jì)算結(jié)果見表3。n為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液測定次數(shù)，n=6。經(jīng)計(jì)算，SR為0.06602。

表3 氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)曲線殘差計(jì)算表(n=6)Table 3 Calculation table of standard curve residuals of Ofloxacin

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度根據(jù)公式(3)。

(3)

其中，a為斜率；p為單份樣品測定次數(shù)p=1；

ci為標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各點(diǎn)質(zhì)量濃度(ng/mL)。

(4)

(5)

2.2.1.2 重復(fù)測定引入的不確定度urel(A2)

(6)

由此，由重復(fù)測定引入的相對不確定度公式(7)。

(7)

2.2.1.3 回收率校正因子引入的不確定度urel(A3)

在實(shí)驗(yàn)過程中，由于人員操作、所用器具和設(shè)備等原因，樣品處理后氧氟沙星含量會有所改變。本研究采用向不含氧氟沙星的陰性黑魚樣品加入與陽性黑魚樣品含量相當(dāng)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢測，定容體積2mL，測定結(jié)果和回收率如表4所示。計(jì)算平均回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差公式(8)。

表4 加標(biāo)回收率測定結(jié)果Table 4 Result of standardaddition recovery rate

(8)

因此，由回收率引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(A3)=0.01157。

故本方法A類不確定度根據(jù)公式(9)。

(9)

urel(A)為0.01956。

2.2.2 B類不確定度評估

2.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度urel(B1)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度urel(B1.1)：根據(jù)氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書，該氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度99.3%，擴(kuò)展不確定度2.0%(k=2)，按正態(tài)分布，則：

(10)

(11)

(12)

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程引入的不確定度urel(B1.4)：在實(shí)驗(yàn)過程中，僅加入內(nèi)標(biāo)體積這一過程可對最終結(jié)果造成影響，因此，關(guān)于內(nèi)標(biāo)，本研究僅考慮配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液過程中加入內(nèi)標(biāo)體積使用器具引入的不確定度，不考慮內(nèi)標(biāo)稱樣量、純度等。配制標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液和工作溶液所用容量瓶具經(jīng)鑒定均為A級，按照J(rèn)JG 196-2006[24]，屬于三角形分布，用最大允差計(jì)算不確定度，如表5所示。使用移液槍按校準(zhǔn)證書計(jì)算不確定度，如表6所示。

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用玻璃量具引入的不確定度Table 5 Uncertainty of volumetric glassware in the preparation of standard solution

表6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中使用移液槍引入的不確定度Table 6 Uncertainty of pipettor in the preparation of standard solution

經(jīng)計(jì)算，urel(B1.4)=0.01346。

(13)

2.2.2.2 樣品前處理引入的不確定度urel(B2)

加入內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度urel(B2.2)：用100μL移液槍吸取60μL D5-諾氟沙星內(nèi)標(biāo)工作液，根據(jù)校準(zhǔn)證書測量不確定度為0.30μL，k=2，則：urel(B2.2)=0.002500。

(14)

則樣品前處理引入的不確定度：

urel(B2)=

(15)

2.2.2.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀引入的不確定度urel(B3)

查所使用的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀校準(zhǔn)證書，該儀器測量結(jié)果的相對不確定度urel=5%，k=2，則該儀器引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

(16)

故本方法B類不確定度根據(jù)公式：

(17)

urel(B)為0.03041。

2.3 合成不確定度和擴(kuò)展不確定度

2.3.1 合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表7 測量不確定度分量Table 7 Uncertainty components of measurement

(18)

2.3.2 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果報告

按照農(nóng)業(yè)部1077號公告-1-2008[22]保留三位有效數(shù)字，根據(jù)JJF 1059.1-2012[17]，取置信區(qū)間P=95%，包含因子k=2，測定樣品氧氟沙星含量為16.6μg/kg。根據(jù)公式(19)：

U=urel(X)×2×16.6=1.2μg/kg

(19)

最終結(jié)果可表示為氧氟沙星含量X氧氟沙星=(16.6±1.2)μg/kg。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜內(nèi)標(biāo)法測定黑魚中氧氟沙星的不確定度評定數(shù)學(xué)模型。內(nèi)標(biāo)法的應(yīng)用，在一定程度上可消除前處理操作、色譜條件微小變化等帶來的誤差及基質(zhì)效應(yīng)干擾，可有效提高定量的準(zhǔn)確性，起到質(zhì)量控制作用。建立的數(shù)學(xué)模型可用于查找檢測過程中對檢測結(jié)果產(chǎn)生影響的因素，為評價測定方法及結(jié)果的準(zhǔn)確性提供了可靠依據(jù)。

根據(jù)數(shù)據(jù)分析影響不確定度的因素包括標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品前處理、測量重復(fù)性等。結(jié)果表明，儀器測量結(jié)果、標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度最大。因此，建議實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期開展相關(guān)儀器的校準(zhǔn)檢定及期間核查。同時為控制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液配制過程中產(chǎn)生的誤差，應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)過程，使用較高純度標(biāo)準(zhǔn)品、高校準(zhǔn)級別的容量瓶及校準(zhǔn)合格的移液器，根據(jù)實(shí)際需求選擇合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍。另外，還應(yīng)提高實(shí)驗(yàn)人員操作規(guī)范性和熟練度，增加平行樣及平行測定次數(shù)，盡可能減小檢測過程中帶來的不確定度，從而提高測定結(jié)果的科學(xué)性、準(zhǔn)確性和可靠性。本模型的建立為實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制及其他類似測定的正確評價提供科學(xué)可靠的依據(jù)。