“ 紅顏”草莓莖尖組織培養(yǎng)及其果實芳香成分分析

梁正鮮，黃 強，張馨予，李春斌

(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連 116605)

草莓屬于薔薇科草莓屬草本植物，目前已知的草莓屬(Fragaria)約有24種[1]，經(jīng)過育種學家的不斷選育，草莓栽培品種己超過兩千。草莓果實鮮美紅嫩，無果皮，果肉多汁，味道爽口怡人，不僅富含糖類、膳食纖維、維生素、礦物質和氨基酸等營養(yǎng)物質，而且含有花青素等功能成分[2]，深受人們的喜愛。因其具有適應性強、結果早、生長周期短的優(yōu)勢，成為世界范圍內(nèi)的重要經(jīng)濟作物[3]。草莓多以無性繁殖為主[4]，該繁殖方式導致草莓極易感染病毒，草莓本身對病毒并沒有免疫能力，目前尚沒有特效方法或外用藥劑可以治愈病毒病，獲得草莓無病毒苗的有效方法仍是通過組織培養(yǎng)脫毒，得到無病毒試管苗，然后將無病毒苗進行擴繁，從而滿足市場的需求[5]。建立“紅顏”草莓快速繁殖體系，對草莓脫毒苗的工廠化生產(chǎn)具有重要意義。

芳香成分是構成和影響果實風味和加工質量的主要因素，草莓具有濃郁的香味，成熟草莓果實香氣由多種芳香成分共同作用而成，這些芳香物質只占草莓鮮重的0.001%～0.010%[7]，但對果實風味起著重要的作用。本試驗采用固相微萃取(Solid-Phase Microextraction,SPME)技術與氣相色譜-質譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometer,GC-MS)聯(lián)用技術相結合的方法對“紅顏”草莓果實的芳香成分進行分析，以確定“紅顏”草莓果實的芳香成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試材料為大連市高原草莓脫毒苗繁育工程研究中心草莓種植基地栽培的“紅顏”草莓。

SPME固相萃取頭，GCMS-QP2010plus氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，日本島津公司。

1.2 方 法

1.2.1 外植體消毒

從室外栽培的“紅顏”草莓植株上剪取4 cm匍匐莖，置于75%酒精擦拭消毒過的冰盒中，帶回實驗室后用洗潔精洗去匍匐莖上的油脂，自來水流水沖洗1～2 h，瀝干水分置于無菌瓶內(nèi)，在無菌室中用75%酒精振蕩洗滌45 s，立即用無菌水沖洗30 s，后置于2%次氯酸鈉溶液中振蕩洗滌8 min，取出后用無菌水沖洗5次，每次30 s，再用無菌吸水紙吸干匍匐莖表面水分備用。

1.2.2 “紅顏”草莓初代培養(yǎng)激素濃度配比篩選

將處理好的“紅顏”草莓莖尖置于解剖鏡下用解剖刀逐層剝離外層幼葉直至露出嫩黃色的半球形子彈頭狀的頂端分生組織，切取大小為0.1～0.5 mm的莖尖，接種于裝有50 mL誘導培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進行莖尖誘導萌發(fā)培養(yǎng)?；A培養(yǎng)基選擇MS培養(yǎng)基，每升MS培養(yǎng)基中加入30.0 g蔗糖和7.0 g瓊脂，培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)至5.8。按照《草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術規(guī)程》中對草莓初代培養(yǎng)基的激素濃度要求，添加不同濃度的6-BA和相同濃度不同種類的生長素(吲哚乙酸、α-萘乙酸)，每瓶接種5個莖尖，每種配方接種10瓶，室溫(25±2)℃，光強度1 500 lx，每天光照12 h，統(tǒng)計接種14天后成活率和生長情況。

1.2.3 “紅顏”草莓芽增殖分化培養(yǎng)激素濃度配比篩選

將長勢良好的試管苗接種到裝有50 mL繼代培養(yǎng)基的接種瓶中進行芽增殖分化培養(yǎng)，基礎培養(yǎng)基選擇MS培養(yǎng)基，每升MS培養(yǎng)基中加入30.0 g蔗糖和7.0 g瓊脂，培養(yǎng)基pH為5.8。按照《草莓脫毒種苗生產(chǎn)技術規(guī)程》[7]中對草莓初代培養(yǎng)基的激素濃度要求，添加不同濃度的6-BA和相同濃度不同種類的生長素(吲哚乙酸、α-萘乙酸和吲哚丁酸)，每瓶接種3個脫毒苗，每個配方接種5瓶，室溫(25±2)℃，光強度1 500 lx，每天光照12 h，統(tǒng)計接種14天后芽增殖率和生長情況。

1.2.4 “紅顏”草莓芳香成分分析

(1)SPME取樣。取樣前先將固相微萃取頭在氣相色譜進樣口以250 ℃溫度進行老化2 h。選取成熟的“紅顏”草莓新鮮果實用刀片切碎后，連同轉子一起迅速裝進15 mL樣品瓶內(nèi)，樣品瓶的上部留2 cm空隙，加蓋密封。使老化好的萃取頭不碰到果肉插入樣品瓶的頂空部分，在集熱式恒溫加熱磁力攪拌器上萃取40 min，萃取溫度40 ℃，然后將萃取頭插入氣相色譜-質譜聯(lián)用儀，250 ℃解析5 min，進行氣相色譜-質譜檢測分析。

(2)GC-MS分析條件。色譜條件：DB-5毛細色譜柱(1.0 μm，0.32 mm×50 m)；載氣為稀有氣體He，不分流，恒流1 mL·min-1；進口溫度250 ℃。柱溫起始溫度為40 ℃，保持1 min后以5 ℃·min-1的速度升到120 ℃，再以8 ℃·min-1的速度升到200 ℃，最后以12 ℃·min-1的速度升到250 ℃并保持7 min。質譜條件：離子源溫度設置為200 ℃；電離方式為EI，電子能量70 eV。

2 結果與分析

2.1 激素濃度對“紅顏”草莓生長的影響

不同濃度6-BA與相同濃度的兩種生長素的不同配比對“紅顏”草莓莖尖的誘導在成活率上存在一定差異，各處理培養(yǎng)基配方及莖尖成活率見表1。

表1 初代培養(yǎng)基激素對莖尖生長的影響

綜合分析表1，6-BA濃度對“紅顏”草莓莖尖成活率有較大影響，隨6-BA濃度的增大，莖尖成活率先增大后減小，6-BA濃度為0.4 mg·L-1時莖尖成活率最高。從不同類型生長素對“紅顏”草莓莖尖的誘導成活率來看，IAA的效果優(yōu)于NAA；兩種激素綜合來看，A3>A4>A0>A2>A6>A5>A1，即在添加有0.40 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中添加0.10 mg·L-1IAA莖尖成活率最高，成活率可達65%，長勢良好；其次是在添加有0.4 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中添加0.10 mg·L-1NAA，成活率達58%，長勢較好。

2.2 激素濃度對“紅顏”草莓芽分化增殖的影響

不同濃度6-BA與相同濃度的三種生長素的不同配比對“紅顏”草莓莖尖的誘導在芽增殖倍數(shù)上存在一定差異，各處理培養(yǎng)基配方及繼代脫毒苗的芽增殖分化情況見表2。

表2 芽增殖分化培養(yǎng)基不同激素對芽增殖的影響

綜合分析表2，不同濃度6-BA對“紅顏”草莓芽增殖分化具有較大影響，分化適宜濃度范圍為0.30～0.50 mg·L-1，在6-BA的適宜濃度范圍內(nèi)，隨著6-BA濃度的增大，分化效果提高，超過0.50 mg·L-1植株則會發(fā)生萎蔫、枯黃的現(xiàn)象，如C1、C2、C3處理。不同類型生長素對“紅顏”草莓芽增殖分化效果，IAA的效果最好，其次為NAA；綜合兩種激素配比的芽增值倍數(shù)，處理C5的效果最好，即在添加0.50 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中添加0.10 mg·L-1IAA效果最好，增值倍數(shù)可達2.67，并且植株健壯，長勢良好，葉片無枯黃斑駁等現(xiàn)象。

2.3 “紅顏”草莓GC-MS分析結果

氣相色譜-質譜聯(lián)用儀檢測所得的“紅顏”草莓果實中揮發(fā)性物質成分氣相色譜-質譜分析總離子圖如圖1。各組分質譜經(jīng)計算機譜庫檢索及化源網(wǎng)CAS號查詢分析，檢測出的揮發(fā)性物質成分見表3。

圖1 “紅顏”草莓揮發(fā)性成分的總離子圖

表3 “紅顏”草莓中揮發(fā)性物質化合物成分氣相色譜-質譜分析結果

續(xù)表3 “紅顏”草莓中揮發(fā)性物質化合物成分氣相色譜-質譜分析結果

本實驗從“紅顏”草莓成熟果實中共檢測出76種揮發(fā)性物質，占總峰面積的55.18%。醇類化合物10種，占總峰面積的21.96%；酯類化合物43種，占總峰面積的19.85%；醛類化合物8種，占總峰面積的9.84%；酮類化合物4種，占總峰面積的0.10%，主要化合物占總峰面積的51.81%。占峰面積含量相對較高的幾種化合物依次為：橙花叔醇>己酸甲酯>芳樟醇>2-己烯醛>桃醛。據(jù)有關研究報道[6]，芳香類物質對果實香氣的貢獻是依據(jù)香氣含量/香氣閾值來劃分的，其中具有較高香氣值的揮發(fā)性物質成為特征香氣成分，成熟草莓中酯類和呋喃酮類的含量越高，果實的風味越濃。

3 結果與討論

激素是影響植物組織培養(yǎng)的一個關鍵因素，在植物組織培養(yǎng)中，由于激素的積累作用，要有效的誘導一種植物產(chǎn)生苗或促進嫩莖良好的增殖，所需求的激素種類和濃度在不同的培養(yǎng)階段是不同的[8]。本研究以優(yōu)質“紅顏”草莓匍匐莖作為外植體，研究發(fā)現(xiàn)，在配方為MS+0.4 mg·L-16-BA+0.10 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基中莖尖的成活率最高，可達到65%，且長勢良好；在配方為MS+0.5 mg·L-16-BA+0.01 mg·L-1IAA的培養(yǎng)基中芽的增殖效果最佳，增殖倍數(shù)可達2.67，并且植株健壯，長勢良好，隨著6-BA濃度的增加，“紅顏”草莓芽增殖倍數(shù)增大，但增殖倍數(shù)過大時容易引起變異，因此實驗中6-BA的濃度不宜過高。

SPME技術結合GC-MS可以避免使用大量的有機溶劑，簡化樣品前處理時間，是一種準確、快捷、有效的芳香成分測定方法。本研究利用SPME-GC-MS技術，在成熟的“紅顏”草莓果實中共檢測出揮發(fā)性化合物76種，占總峰面積55.18%，含量相對較高的芳香成分依次為：橙花叔醇>己酸甲酯>芳樟醇>2-己烯醛>桃醛，對成熟的“紅顏”草莓果實風味貢獻值大的酯類化合物占總峰面積的19.85%，為鮮食“紅顏”草莓品質評價提供科學依據(jù)。