維吾爾藥青香茅質(zhì)量控制研究

趙榮梅，徐鴻，馬方圓，艾買提江·阿衣甫別克，于新蘭，張軍，2

1.新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院，中藥（維藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830054；2.國家藥典委員會(huì)，北京 100061

維吾爾醫(yī)常用藥青香茅為禾本科香茅屬魯沙香茅組青香茅Cymbopogon caesius（Ness）Stapf.的干燥莖葉[1-2]，其性質(zhì)二級干熱，味辛[3]，具開通脈絡(luò)阻滯、熟化黏稠體液、祛寒通經(jīng)等功效，主要用于機(jī)體癱瘓、癡呆健忘、肝腫、寒性疼痛、腹水經(jīng)閉等[4]?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·維吾爾藥分冊》[2]，其名稱為香茅，來源為青香茅及其同屬數(shù)種植物的干燥莖葉。在新疆地產(chǎn)特色民族藥復(fù)方木尼孜其顆粒、降糖孜亞比提片、舒肢巴亞待都司片[2]等成藥處方中，青香茅為主要臣藥。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容僅有性狀、性質(zhì)、功能與主治等項(xiàng)目，不能有效控制藥材質(zhì)量。同屬植物檸檬草Cymbopogon citratus，別稱香茅，為禾本科香茅屬檸檬草組植物，常與青香茅混用。因此，青香茅藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升對傳統(tǒng)民族醫(yī)藥的規(guī)范用藥具有必要性。

本研究采用水蒸氣蒸餾法測定青香茅揮發(fā)油含量，通過氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）確定揮發(fā)性成分，以胡椒酮為指標(biāo)成分建立含量測定方法，并增訂其顯微、薄層色譜鑒別及水分、浸出物檢查，為進(jìn)一步提高青香茅質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

HM525 NX冷凍切片機(jī)，美國賽默飛世爾科技公司；BX-51型生物顯微照相系統(tǒng)，日本OLYMPUS；TLC Visualizer型薄層色譜成像系統(tǒng)，瑞士CAMAG；KUDOS SK7210LHC型超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；AUTOMATIC TLC SAMPLER 4全自動(dòng)點(diǎn)樣儀，瑞士CAMAG；Trace 1310型單四極桿氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國賽默飛世爾科技公司；7890A型氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；MS204S型電子天平，瑞士梅特勒-托利多；XT-1000A型高速多功能粉碎機(jī)，浙江永康市紅太陽機(jī)電有限公司；Agilent DB-5型色譜柱（30 m，0.32 mm，0.25 μm）。

14批青香茅藥材購自新疆不同地區(qū)維吾爾藥材市場和維吾爾醫(yī)院，分別為巴基斯坦進(jìn)口（批號20160608、20151227、20160827、20170402、20160501、20170906）和新疆地產(chǎn)（批號20170804-1、20170610、20200301、20200402、20190509、20200201、20200130、20170804-2），均由新疆維吾爾自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院蘇來曼·哈力克主任藥師鑒定，為禾本科香茅屬植物青香茅Cymbopogon caesius（Ness）Stapf.的干燥莖葉。胡椒酮對照品（Panphy，批號FP019801，含量95.5%），水楊酸甲酯對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110707-201413，含量99.7%），咖啡酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110885-201703）；青香茅對照藥材（實(shí)驗(yàn)室自制，批號20200519）。硅膠G薄層板（煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所，批號20200430；Merck KCaA，批號HX56235353）。甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 顯微鑒別

2.1.1 橫切面顯微特征

分別取藥材葉片和莖，置于冷凍切片機(jī)，切片，將樣品薄片置載玻片上，加水合氯醛溶液透化后，在顯微鏡下觀察，拍照記錄。葉片橫切：上表皮細(xì)胞由1列小長圓形細(xì)胞組成，橫向排列；上下表皮之間為大型的薄壁細(xì)胞，下表皮有大型盾狀維管束；木質(zhì)部呈“V”形，木質(zhì)部與韌皮部之間有2～3個(gè)空腔；非腺毛較多，尤以凹陷處為最。莖橫切：外表皮細(xì)胞3～5列，類圓形，橫向排列整齊；中皮層類圓形，數(shù)列，靠近中皮層有大量散在的外韌型維管束；皮層由大小不一的基本組織細(xì)胞組成。見圖1。

圖1 青香茅藥材橫切面顯微特征

2.1.2 粉末顯微特征

藥材粉末呈黃綠色至黃棕色，取藥材細(xì)粉適量，置載玻片上，加水合氯醛溶液透化后，置顯微鏡下觀察，拍照記錄?？梢姳砥ぜ?xì)胞類長方形，垂周壁波狀彎曲，氣孔較多，平軸式；纖維細(xì)長，多成束，壁厚，有時(shí)可見棕色分泌管；非腺毛多見；薄壁細(xì)胞較大，含棕色物質(zhì)；石細(xì)胞成群或單個(gè)散在，類長方形或類圓形，壁厚；螺紋導(dǎo)管多。見圖2。

圖2 青香茅藥材粉末顯微特征（×400）

2.2 薄層色譜鑒別

取藥材粉末5 g，加甲醇50 mL，超聲（功率350 W，頻率53 kHz）處理30 min，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取青香茅對照藥材5 g，同法制成對照藥材溶液。另取咖啡酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0502）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對照藥材溶液各5 μL、對照品溶液3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲酸-乙酸乙酯（5∶1∶3）為展開劑展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見圖3。

圖3 青香茅藥材薄層色譜圖

2.3 水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及揮發(fā)油含量測定

按《中華人民共和國藥典》2020年版四部通則0832水分測定法甲苯法、2302灰分測定法、2201醇溶性浸出物測定法（以稀乙醇為溶劑）、2204揮發(fā)油測定法甲法分別測定14批樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和揮發(fā)油含量。每批樣品平行測定2次，取平均值。結(jié)果水分含量為5.00%～6.50%，平均值為5.78%；總灰分含量為6.73%～12.68%，平均值為9.03%；酸不溶性灰分含量為4.45%～9.67%，平均值為6.47%；浸出物含量為5.22%～12.99%，平均值為10.36%；揮發(fā)油含量為1.21%～2.65%，平均值為1.80%。見表1。

表1 青香茅藥材水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物和揮發(fā)油含量測定結(jié)果（%，n＝2）

2.4 揮發(fā)性成分分析

2.4.1 氣相色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：以5%二苯基-95%二甲基硅氧烷為固定相的毛細(xì)管柱，程序升溫（起始溫度60 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持4 min，再以10 ℃/min升溫至280 ℃，保持4 min），進(jìn)樣口溫度250 ℃。

質(zhì)譜條件：采用正離子模式，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度280 ℃，全掃描范圍20～650 amu。

2.4.2 溶液制備

取藥材粉末（過3號篩）1 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲（功率350 W，頻率53 kHz）處理30 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液1 mL，置10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

精密稱取胡椒酮對照品適量，加甲醇溶解并稀釋成每1 mL含胡椒酮0.05 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.4.3 樣品測定

精密量取供試品溶液1 μL注入氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，采集數(shù)據(jù)。通過GC-MS計(jì)算機(jī)譜庫檢索，并結(jié)合相似度指數(shù)，共鑒定出8個(gè)主要化合物，均為萜類化合物。單萜型有2-甲基異丙醇（2-methylisobomel，C1）和胡椒酮（piperitone，C2），愈創(chuàng)木醇型有hedycaryol（C3）和5-guaien-11-ol（C5），倍半萜類有α-桉葉醇（α-eudesmol，C4）、β-桉葉醇（β-eudesmol，C6）、(+)-maaliol（C7）和1b,5,5,6a-tetramethyl-octahydro-6H-indeno[1,2-b]oxiren-6-one（C8）。

由供試品總離子流圖（見圖4）可見，胡椒酮為最大特征峰。精密量取對照品溶液1 μL，進(jìn)樣檢測，結(jié)果見圖5。經(jīng)比對，胡椒酮可作為定量成分。

圖4 青香茅藥材供試品溶液總離子流色譜圖

圖5 胡椒酮質(zhì)譜圖

2.5 胡椒酮含量測定

2.5.1 色譜條件

以苯基（5%）甲基聚硅氧烷毛細(xì)管柱為固定相，程序升溫（初始溫度60 ℃，保持3 min，以10 ℃/min升溫至110 ℃，再以3 ℃/min升溫至150 ℃，再以20 ℃/min升溫至280 ℃，保持4 min），進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1。理論塔板數(shù)按胡椒酮峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批藥材粉末樣品6份，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算胡椒酮平均含量為0.75%，RSD＝1.8%。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液，室溫放置0、1、3、6、10、

2.5.2 溶液制備

取水楊酸甲酯對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，即得內(nèi)標(biāo)溶液。取胡椒酮對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.2 mg的溶液，精密量取2 mL，置10 mL容量瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取藥材粉末（過3號篩）1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇30 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率350 W，頻率53 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液8 mL，置10 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.5.3 線性關(guān)系考察

精密量取胡椒酮對照品溶液（1.178 8 mg/mL）0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液1 mL，用甲醇稀釋定容并搖勻，配制成系列濃度對照品溶液。按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，以胡椒酮對照品濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)，胡椒酮與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程Y＝3.057 7X－0.036 1（r＝0.999 9），胡椒酮濃度在58.94～943.04 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.5.4 檢出限與定量限

以信噪比（S/N）為3∶1和10∶1為基準(zhǔn)，胡椒酮的檢出限為5.89 μg，定量限為17.68 μg。12 h，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，計(jì)算胡椒酮的平均含量為0.70%，RSD＝0.69%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取同一批藥材粉末（過3號篩）0.5 g，置錐形瓶中，共6份，分別精密加入胡椒酮對照品溶液（3.086 6 mg/mL）1.0 mL，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果胡椒酮平均回收率為94.7%，RSD＝1.0%，見表2。

表2 胡椒酮加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.5.8 樣品測定

取14批青香茅藥材，按“2.5.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批樣品平行處理2份，按“2.5.1”項(xiàng)下色譜條件測定，每份測定2次，結(jié)果見圖6、表3。

表3 14批青香茅藥材中胡椒酮含量測定結(jié)果（%，n＝2）

圖6 青香茅藥材含量測定GC圖

3 討論

香茅屬植物中含綠原酸、咖啡酸等酚酸類成分[5]，異葒草素、葒草素等黃酮類成分[6]，β-谷甾醇等三萜類成分，以及檸檬醛、香葉醛、香茅醛、香葉醇、月桂烯、紫蘇烯、丁香酚、乙酸香葉酯等揮發(fā)性化學(xué)成分[7-13]。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，將咖啡酸作為薄層色譜鑒別的目標(biāo)成分，斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，咖啡酸對照品溶液放置12 h后，出現(xiàn)2個(gè)熒光斑點(diǎn)，故應(yīng)臨用現(xiàn)制?？疾毂由V鑒別樣品處理方法時(shí)，分別采用甲醇、乙醇、乙酸乙酯為溶劑，超聲處理30 min和水浴回流4 h提取進(jìn)行測定，結(jié)果以甲醇超聲處理30 min制備的供試品溶液咖啡酸含量最高?？疾旌繙y定樣品處理方法時(shí)，分別采用不同濃度甲醇、乙醇為溶劑，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30，超聲處理20、30、40 min提取進(jìn)行測定，結(jié)果以甲醇為溶劑、料液比為1∶30、超聲處理30 min制備的供試品溶液胡椒酮含量最高?？疾旖鑫锾崛》椒〞r(shí)，分別選取水和不同濃度乙醇溶液，采用冷浸法和熱浸法，對藥材浸出物進(jìn)行考察，與試驗(yàn)操作簡便、快速等特性相結(jié)合，選定溶劑和提取方法，結(jié)果以稀乙醇為溶劑采用熱浸法提取后浸出物含量最高。

檸檬草藥材（別稱香茅）的化學(xué)成分和藥理活性研究已有報(bào)道[7，14-15]。楊穎等[16]對青香茅藥材的糖苷類成分進(jìn)行含量測定，但揮發(fā)性化學(xué)成分研究甚少。本試驗(yàn)通過GC-MS確定青香茅藥材的主要揮發(fā)性特征成分有8個(gè)，選取指標(biāo)性成分胡椒酮，建立了含量測定方法，可進(jìn)一步完善青香茅藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。