超聲輔助提取鯢皮膠原蛋白工藝優(yōu)化及結構特征分析

李 根，任國艷,2,3, ，李 倩，周 明，張軼馨，肖 楓

（1.河南科技大學食品與生物工程學院，河南洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術研究中心，河南洛陽 471023；3.國家食品加工與安全教育實驗示范中心，河南洛陽 471023）

膠原主要存在于動物的各種結締組織中，起支撐和保護作用，約占動物總蛋白的30%。膠原蛋白具有生物相容性好、抗原性低、凝膠乳化、降解、保水、促進細胞定向黏附生長等特點，已廣泛應用于食品、化妝品、生物醫(yī)用材料等領域[1]。膠原蛋白的主要來源是陸生動物，如牛、豬、馬和其他死后動物的廢棄物[2]，但考慮到宗教信仰對一些動物有禁忌，以及存在瘋牛病等人畜共患傳染病的隱患，目前常采用水生動物，如海參、尼羅羅非魚魚皮等加工廢棄物為原料提取膠原蛋白[3-4]。然而，關于從兩棲類動物及其廢棄物中提取膠原蛋白研究相對較少。目前已報道的兩棲類研究僅有蛙[5-6]、甲魚[7]和大鯢[8]。

人工養(yǎng)殖的大鯢是中國特有的大型兩棲動物，可以加工食用。鯢皮中膠原蛋白含量較高，可以通過不同的提取方法從鯢皮中提取膠原蛋白[9]。由于鯢皮表皮結構致密，膠原溶出困難，常規(guī)提取方法提取率較低，故一般通過輔助方法提高其提取率。超聲輔助提取技術由于其空化效應導致細胞內(nèi)物質(zhì)的快速釋放、擴散和溶解[7]。與傳統(tǒng)提取方法相比，超聲輔助提取技術具有提取時間短、效率高、對有效成分結構破壞小、提取溫度可控等優(yōu)點，在食品工業(yè)中得到了廣泛的應用。故本研究采用超聲輔助處理鯢皮，通過單因素實驗探究固液比、超聲時間、超聲功率對膠原蛋白產(chǎn)量的影響。采用響應面分析法對提取工藝進行優(yōu)化，獲得鯢皮膠原蛋白提取的最佳工藝參數(shù)。對比分析了超聲輔助提取率和超聲輔助提取的鯢皮膠原蛋白的結構特性，以期為膠原蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)和后續(xù)的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮大鯢 洛陽華鯢生物科技股份有限公司；L-羥脯氨酸標準品 北京盛世康普化工技術研究院；胃蛋白酶（1:3000 IU） 上海藍季生物公司；本研究使用的其他化學試劑 均為分析級。

KQ-600VDV超聲清洗儀 昆山超聲儀器有限公司；TM3030Plus掃描電鏡 日本日立高新技術公司；VERTEX70傅里葉變換中遠紅外光譜儀 德國BRUKER公司；A300氨基酸自動分析儀 德國曼默博爾公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 鯢皮膠原提取工藝流程 本法采用酶法提取膠原蛋白，選用胃蛋白酶做酶解劑，胃蛋白酶提取可保留膠原蛋白相對完整的三螺旋結構[10]。

鯢皮經(jīng)預處理、除雜、脫脂、超聲處理（未處理）、酶解、離心、鹽析和透析流程后，再經(jīng)冷凍干燥，即可得到鯢皮膠原蛋白。具體工藝步驟如圖1所示。

圖1 鯢皮膠原蛋白提取工藝圖Fig.1 Extraction process of salamander skin collagen

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 超聲功率對膠原蛋白提取率影響 取預處理好鯢皮50 g，在液固比20 mL/g、超聲時間20 min時，探究超聲功率（60、120、180、240和300 W）對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.2.2 超聲時間對膠原蛋白提取率影響 取預處理好鯢皮50 g，在液固比20 mL/g、超聲功率180 W時，探究超聲時間（10、15、20、25和30 min）對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.2.3 液固比對膠原蛋白提取率的影響 取預處理好鯢皮50 g，在超聲功率180 W、超聲時間25 min時，探究液固比（10:1、15:1、20:1、25:1及30:1 mL/g）對膠原蛋白提取率的影響。

1.2.3 響應面設計 通過單因素實驗，選取各因素對膠原蛋白提取率影響較大的三個水平，利用Design-Expert 8.0對三因素三水平BBD模型進行設計和分析，確定超聲輔助提取的最佳條件。因素水平編碼表見表1。

表1 Box-Behnken設計中試驗因素水平代碼表Table 1 Codes and levels of test factors in Box-Behnken design

在17輪試驗中檢測了超聲功率（X1）、超聲時間（X2）和液固比（X3）三個自變量對膠原提取率（Y）的影響。對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，擬合二次多項式模型[11]：

式中，Y為響應變量（膠原產(chǎn)率）；偏移項β0；一次項為βi；二次項為βii；相互作用項為βij；編碼自變量為Xi和Xj。

1.2.4 鯢皮膠原蛋白提取率測定 采用羥脯氨酸標準曲線法檢測膠原蛋白提取率。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征氨基酸，膠原蛋白的含量可由其所含的羥脯氨酸含量乘以換算系數(shù)得到。參照文獻[12-13]方法，以吸光值為縱坐標，L-羥脯氨酸含量為橫坐標，繪制標準曲線?？傻脴藴是€為y=0.0662x+0.0007，R2=0.999。

樣品（圖1中上清液）消化后，過濾，蒸餾水定容，取1 mL濾液[8]，按照標準曲線的方法測定其吸光值，根據(jù)L-羥脯氨酸標準曲線算出待測樣品的羥脯氨酸含量，通過換算，計算出膠原蛋白提取率。

式中：W為膠原蛋白提取率，%；ω為待測液中羥脯氨酸含量，mg/mL；V為待測液體積，mL；11.1為羥脯氨酸換算系數(shù)；D為稀釋倍數(shù)；M為鯢皮中膠原蛋白含量，mg。

1.2.5 掃描電鏡 利用離子濺射儀對經(jīng)超聲處理和未經(jīng)超聲波處理的凍干小片大鯢皮進行噴金處理，掃描電鏡真空狀態(tài)下觀察其微觀結構[14]，放大倍數(shù)為50倍，用同樣的方法對UAEEC和EEC進行了掃描電鏡觀察，放大倍數(shù)為100倍。

1.2.6 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE） 參照Laemmli[15]的方法，采用垂直板型電泳裝置，使用質(zhì)量分數(shù)為8%的分離膠和5%的濃縮膠，電壓為100 V。電泳結束后，膠板使用0.5%的考馬斯亮藍（R250）染色2 h，然后使用脫色液（乙酸:乙醇:蒸餾水=3:5:35）使膠板脫色，直至條帶清晰。脫好色的膠板使用凝膠成像儀掃描凝膠成像。

1.2.7 傅里葉紅外光譜（FT-IR） 參照Ren等[16]，對凍干的樣品與干燥的溴化鉀研磨，壓成透明薄片，放入中遠紅外光譜掃描儀，在4000～400 cm-1的范圍內(nèi)進行測量。

將紅外波譜圖中1600～1700 cm-1的譜帶（酰胺I帶）進行基線校正，用9點平滑后，進行二階導數(shù)和傅里葉解卷積技術，確定每個子峰的峰位和半峰寬度。用高斯函數(shù)對光譜進行擬合,通過多重擬合將最小殘差重疊的不同譜帶完全區(qū)分開來。確定各子峰與不同二級結構之間的對應關系，并根據(jù)其積分面積計算出各種二級結構的相對含量百分比。

1.2.8 氨基酸分析 參照Garmen等[17]，樣品使用6 mol/L鹽酸溶解，真空狀態(tài)下在110 ℃水解24 h，水解完全后，過濾，定容。從容量瓶中移取1 mL置于5 mL離心管內(nèi)，氮吹儀處理至離心管內(nèi)剩余少量殘余，加入1 mL樣品緩沖液震蕩混勻后，用0.45 μm濾膜過濾到樣品瓶中做好標記備用。將標記好的樣品瓶放入全自動氨基酸分析儀中測定其氨基酸組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本試驗每個樣品重復測定3次，數(shù)據(jù)用平均值±標準偏差表示，采用 Microsoft Excel 2010對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，用SPSS 25對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析（差異顯著，P＜0.05）并應用Origin 2017軟件繪制作圖。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

圖2 A顯示了超聲功率對膠原提取率的影響。隨著超聲功率從60 W增加到180 W，膠原蛋白的產(chǎn)率也隨之提高，在180 W時，膠原蛋白的提取率達到最大值，為37.19%，當超聲功率再次增大時，提取率呈下降趨勢。這一現(xiàn)象的原因是超聲功率的不斷提高能有效地破壞鯢皮表皮的結構，使其結構疏松，促進膠原的溶解；當功率超過一定值時，由于超聲波的空化效應，導致鯢皮組織產(chǎn)生交聯(lián)，不利于膠原的溶解[18]。所以，選擇180 W作為超聲輔助提取鯢皮膠原蛋白的最佳功率。

圖2 B顯示了超聲時間對膠原蛋白提取率的影響。隨著超聲時間的延長，膠原產(chǎn)量明顯增加。在25 min時，膠原產(chǎn)量最高可達37.27%。之后，隨著超聲處理時間的延長，膠原提取率略有下降，說明膠原已被完全提取。由于超聲時間過長會浪費能量和增加生產(chǎn)成本，故選擇25 min為最佳超聲時間[19]。

從圖2C可以看出，液固比從10:1 mL/g增加到30:1 mL/g時，膠原的提取率從29.28%增加到36.19%，這可能是由于溶液傳質(zhì)驅動力的增加[20]。但隨著比例的增加，提取液中超聲能量密度分布減小，膠原提取率略有下降。所以，在此條件下，液固比為20:1 mL/g是從鯢皮膠原蛋白提取的最佳配比。

圖2 不同提取條件對鯢皮膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of different extraction conditions on the extraction rate of collagen from salamander skin

2.2 響應面設計與方差分析

RSM試驗結果如表2所示，數(shù)據(jù)回歸分析結果如表3所示。F值是評價變量對響應值的影響。一般來說，F(xiàn)值越大，對響應值的影響越大。表3中模型的F值為61.94，P＜0.0001，表明該回歸模型極顯著，可靠性高?！笆M項F值”為1.79（P=0.2888＞0.05）意味著“失擬項”相對于純誤差而言不顯著，證實了模型的有效性[21]。

表2 試驗設計與結果Table 2 Experimental design and results

軟件分析得到的二次回歸方程的擬合系數(shù)R2=0.9876＞0.9，表明回歸模型與試驗結果擬合程度較高，但R2最大，并不意味著模型的一致性最好。對于一個好的統(tǒng)計模型，模型調(diào)整確定系數(shù)（R2adj）應該與R2相近，以更好地說明模型[22-23]的有效性。從表3可以看出，調(diào)整系數(shù)R2adj＝0.9717與R2=0.9876非常接近，表明實驗值與預測值吻合較好。此外，變異系數(shù)（C.V.＝0.74%）值很小，表明數(shù)據(jù)精度高，模型可靠性好[24]。通過對實驗數(shù)據(jù)的分析，響應變量與自變量之間存在如下二次多項式關系：

表3 二次多項式模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANDVA) for the quadratic polynomial mode

式中，Y、X1、X2、X3分別表示膠原蛋白提取率（%）、超聲功率（W）、超聲時間（min）和液固比（mL/g）。

根據(jù)F和P值分析（表3），一次項X1和二次項有極顯著影響（P＜0.0001），X2、X3、X1X2、X2X3和影響顯著（P＜0.05），交互作用項X1X3影響不顯著（P＞0.05）。各因素對膠原提取率的影響大小順序為：超聲功率＞超聲時間＞液固比。

2.3 響應面結果分析

圖3 顯示了3D響應曲面圖和各自的等高線圖。這些圖表直觀地評估兩個變量之間是否存在交互作用，并確定該變量的最優(yōu)值[25]。在這項研究中，通過響應面得到膠原蛋白提取率和兩個連續(xù)變量，而另一個變量在零水平上保持不變。圖3（a、b、c）的三維圖像表面均為凸面，最高點落在選定區(qū)域，說明相關因素的選取是合理的。圖3（d、f）中變量的等高線圖趨于橢圓形，表示超聲功率與超聲時間、超聲時間與液固比之間有一個作用更為突出的因素；圖3e中變量的等高線趨于圓形，說明超聲功率和液固比的相互作用不明顯。這與表3的數(shù)據(jù)分析結果一致。

圖3 各因素交互作用的響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface and contour plots of factor interactions

如圖3a所示，響應面沿超聲功率方向的斜率大于超聲時間方向的斜率，說明超聲功率對膠原蛋白產(chǎn)量的影響較大。如圖3b所示，響應面沿超聲功率方向的斜率大于液固比的斜率，說明超聲功率對膠原產(chǎn)量的影響較大。如圖3c所示，響應面沿超聲時間方向的斜率大于液固比的斜率，說明超聲時間對膠原產(chǎn)量的影響較大。實驗結果與上述因素對膠原產(chǎn)量的影響是一致的。

2.4 預測模型驗證

選擇最佳條件對二次多項式方程進行檢驗，預測膠原提取率最高為37.76%，但根據(jù)實際生產(chǎn)操作需要，需要對最佳工藝條件稍作修改：超聲功率為201 W，超聲時間為26 min，液固比為21:1 mL/g，并進行了3次重復驗證實驗。UAEEC的平均提取率為37.36%±2.61%（n=3），與預測值吻合較好。以上結果證實了響應面模型能夠充分、可靠地優(yōu)化鯢皮膠原蛋白的超聲輔助提取工藝[26]。在此條件下，EEC的產(chǎn)率為17.56%±1.77%，說明超聲輔助處理能明顯提高膠原的提取率。

2.5 掃描電鏡分析

根據(jù)掃描電鏡觀察，經(jīng)超聲處理的鯢皮表面有許多較大孔洞（圖4A），這可能是由于超聲波空化，導致表面的一些腺體開口擴張[27]，增加了提取液與表皮之間的接觸面積和深度。孔洞內(nèi)部結構清晰，呈網(wǎng)狀結構。未經(jīng)處理的鯢皮（圖4B），表皮結構相對完整，表皮上孔洞不明顯，完整性較好，不利于膠原蛋白從皮中溶出。此外，還有一些細小的氣孔，這可能是真空冷凍干燥過程中內(nèi)部失水造成的[28]。通過對比可以發(fā)現(xiàn)，超聲處理的鯢皮更有利于膠原蛋白的溶出提取。

圖4 鯢皮和鯢皮膠原的電鏡掃描Fig.4 Electron microscopy scan of Chinese giant salamander skin and Chinese giant salamander skin collagen

圖4 C和圖4D分別顯示了UAEEC和EEC的掃描電鏡結果。兩者均為松散無規(guī)則卷曲的纖維結構，交聯(lián)度較好，有白色片狀的結構與纖維狀膠原結構相連，該片狀結構可能是由于真空冷凍干燥的過程中，膠原蛋白因脫水而產(chǎn)生的聚合，出現(xiàn)部分凝結的聚合物所導致[29]；UAEEC密集程度高于EEC，表明超聲輔助處理使膠原蛋白發(fā)生了聚集[30]。

2.6 SDS-PAGE分析

UAEEC和EEC電泳圖譜都表現(xiàn)出典型的I型膠原特征（圖5），均由一條γ鏈、一條β鏈和兩條α鏈（α1和α2）組成，未觀察到UAEEC和EEC的亞基組成發(fā)生明顯變化，表明超聲波誘導的鯢皮組織的細胞破壞不影響膠原亞基組成的完整性[31]。UAEEC的亞基帶表現(xiàn)出明顯的拖尾現(xiàn)象，表明超聲輔助處理可能對膠原的空間結構局部區(qū)域或二級結構的組成有一定的影響（后續(xù)紅外光譜實驗結果也印證了這一點）。

圖5 鯢皮膠原蛋白SDS-PAGEFig.5 SDS-PAGE of collagen from Chinese giant salamander skin

2.7 紅外光譜分析

從紅外圖譜中（圖6A）可以看出，UAEEC和EEC都存酰胺A、酰胺B和酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的特征吸收峰，與膠原蛋白的紅外特征峰相似[32]。酰胺A與N-H伸縮振動有關，通常在3400～3440 cm-1處有一個吸收峰。當含有N-H基團的多肽參與氫鍵的形成時，會導致酰胺A的吸收峰向低頻移動，通常在3300 cm-1。UAEEC和EEC酰胺A帶的位置分別為3300.09 cm-1和3302.02 cm-1，表明UAEEC和EEC中均有氫鍵的生成，且含量基本相同[33]。酰胺B與CH2的不對稱收縮振動有關，一般出現(xiàn)在2930 cm-1處。UAEEC和EEC均在2925.92 cm-1處有一個吸收峰，表明二者均存在CH2的不對稱收縮振動。酰胺Ⅰ與多肽鏈骨架C=O的伸縮振動有關，對三螺旋結構的變化非常靈敏，一般在1600～1700 cm-1處有吸收峰。UAEEC和EEC分別在1654.87 cm-1和1658.73 cm-1處有吸收峰，表明都存在C=O伸縮振動。酰胺Ⅱ是由平面彎曲中的N-H和C-N伸縮振動共同產(chǎn)生的，位置在1500～1600 cm-1之間。UAEEC和EEC在1543 cm-1和1548.79 cm-1處產(chǎn)生吸收峰，表明均存在酰胺Ⅱ帶的吸收峰。UAEEC和EEC在1240.19 cm-1處有一個吸收峰，為N-H形變振動引起的酰胺Ⅲ帶，表明蛋白存在三螺旋結構。如上所述，紅外圖譜說明超聲輔助處理未明顯改變膠原蛋白的三螺旋結構。

圖6 膠原蛋白紅外光譜和酰胺I去卷積圖譜Fig.6 Collagen infrared spectroscopy and amide I deconvolution mapping

此外，紅外光譜中酰胺Ⅰ帶，通過去卷積處理，可以反映蛋白質(zhì)二級結構的變化（圖6B和圖6C）。1600～1640、1640～1650、1650～1660和1660～1680、1680～1690 cm-1波數(shù)處的峰分別表示β-折疊、無規(guī)卷曲、α-螺旋、β-轉角和反平行β-折疊結構。

從表4可以看出，UAEEC和EEC的二級結構單元含量不同。與EEC相比，UAEEC的α-螺旋含量和β-轉角明顯降低，分別從31.96%降至22.12%、25.37%降至20.67%；β-折疊、反平行β-折疊和無規(guī)卷曲的含量均有所增加，分別由22.83%增加到26.18%、5.46%增加到12.21%、14.38%增加到18.83%。這與黃丹丹等[34]研究的超聲處理金槍魚皮提取的膠原蛋白α-螺旋含量降低，β-折疊含量增加和李可等[35]研究的超聲處理使雞胸肉肌原纖維蛋白α-螺旋含量降低，β-折疊和無規(guī)則卷曲含量提高結果相似。表明，超聲波輔助處理破壞了維持膠原二級結構的分子間力，使膠原的一些理化性質(zhì)和功能特性發(fā)生改變。

表4 EEC和UAEEC的二級結構含量Table 4 Content of secondary structure of EEC and UAEEC

2.8 氨基酸分析

EEC和UAEEC的氨基酸組成如表5所示，EEC中的甘氨酸含量為270.1，UAEEC中的甘氨酸含量為269.6，均占其總氨基酸的四分之一以上，與前人研究的I型膠原蛋白中甘氨酸含量相近[36-37]；EEC和UAEEC的亞氨基氨基酸含量（Pro和Hyp）分別為170.4和171.8。一般認為，Pro與Hyp和Pro的吡咯烷環(huán)的氫鍵結合能力變化會引起膠原蛋白分子結構的二級結構變化。亞氨基酸的含量越高，螺旋的穩(wěn)定性越高，膠原蛋白的熱穩(wěn)定性也就越高[38-39]。因此，可以推測，UAEEC中α-螺旋的減少不是由于亞胺酸含量的變化引起的，而是由于Hyp的氫鍵結合能力降低所致，這可能是由于超聲的空化作用破壞了蛋白結構里分子間氫鍵[40]。EEC和UAEEC的疏水性氨基酸含量分別為315.1和316.3，表明超聲輔助處理對蛋白溶解度無明顯影響。以上結果表明，超聲輔助處理對提取的膠原蛋白的氨基酸組成無明顯影響。

表5 鯢皮膠原蛋白氨基酸組成（殘基數(shù)/1000殘基數(shù)）Table 5 Amino acid profiles from giant salamander skin residues/1000

3 結論

在本研究中，與常規(guī)提取方法相比，超聲輔助提取能明顯提高鯢皮膠原蛋白的提取率。超聲輔助提取最佳工藝條件為：超聲功率201 W，超聲時間26 min，液固比21:1 mL/g，在此條件下，鯢皮膠原蛋白的提取率為37.36%±2.61%。超聲輔助處理能破壞鯢皮表面結構，使溶劑更容易與鯢皮接觸，有利于膠原蛋白的溶出。超聲處理使鯢皮膠原蛋白的二級結構單元α-螺旋和β-轉角含量降低，β-折疊、無規(guī)則卷曲和β-反平行折疊含量升高，微觀結構更加密集，氨基酸組成則無明顯變化。綜上所述，基于中國大鯢鯢皮膠原蛋白的功能、經(jīng)濟優(yōu)勢和生產(chǎn)效率，超聲輔助酶法提取鯢皮膠原蛋白可以作為鯢皮膠原蛋白生產(chǎn)行業(yè)的一種有效方法。