NO延緩新鮮果蔬成熟衰老和提高抗性效果及作用機(jī)制研究進(jìn)展

朱麗娟，侯佳迪，王軍萍，劉少偉，郁志芳

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京 210095）

成熟衰老是新鮮果蔬的重要生物學(xué)過(guò)程，伴隨諸多新陳代謝和外觀的快速變化，通常與細(xì)胞壁的軟化[1]、葉綠素的降解[2]、新色素的合成（如類胡蘿卜素、葉黃素、類黃酮）[1-3]、揮發(fā)性有機(jī)物的積累和釋放[4]、蛋白質(zhì)的合成以及可溶性物質(zhì)含量的改變[3-5]等密切聯(lián)系。與果蔬成熟衰老相關(guān)的代謝則與其體內(nèi)許多重要的酶促和非酶促抗氧化系統(tǒng)有關(guān)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）、過(guò)氧化物酶（POD）、抗壞血酸過(guò)氧化物酶（APX）及谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸（ASA）和酚類物質(zhì)等[6]。雖然上述抗氧化系統(tǒng)能夠使果蔬在成熟衰老初期保持氧化還原平衡，但在成熟衰老的代謝和結(jié)構(gòu)分解過(guò)程中，果蔬仍會(huì)發(fā)生不可逆的氧化應(yīng)激反應(yīng)[7]。新鮮果蔬根據(jù)其成熟期間是否出現(xiàn)呼吸躍變，可分為呼吸躍變型（如蘋(píng)果、桃、香蕉、芒果等）和非呼吸躍變型（如甜橙、草莓、楊梅、黃瓜等）兩類。一般認(rèn)為，果蔬呼吸高峰的出現(xiàn)與植物體內(nèi)乙烯含量的迅速增加有關(guān)。

NO作為一種可自由擴(kuò)散的膜透性信號(hào)分子[5]，參與了果蔬成熟和衰老過(guò)程。Leshem等[8]于1996年提出NO可以通過(guò)抑制乙烯的生成，調(diào)控成熟與衰老進(jìn)程。有研究發(fā)現(xiàn)，果蔬成熟過(guò)程發(fā)生的變化不僅與活性氧（ROS）和抗氧化物代謝有關(guān)，同時(shí)也與NO有關(guān)，并提出在呼吸躍變型和非呼吸躍變型果實(shí)中都存在著硝基-氧化應(yīng)激反應(yīng)[9]。近年來(lái)，多數(shù)研究主要集中于NO對(duì)果實(shí)成熟的影響和調(diào)控機(jī)制及其它與成熟相關(guān)的方面，如貯藏期間的冷害及病原微生物的侵染對(duì)果蔬品質(zhì)產(chǎn)生的影響。利用外源NO調(diào)控果蔬的成熟并應(yīng)用于保鮮，已成為當(dāng)前采后生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。

本文總結(jié)了近年來(lái)NO在果蔬采后延緩成熟衰老、增強(qiáng)冷害和病害抗性方面的效應(yīng)和作用機(jī)制，提出了NO在果蔬采后應(yīng)用的未來(lái)研究方向。

1 NO對(duì)果蔬成熟衰老的影響

1.1 延緩果蔬成熟

NO已被證明在各類果蔬中都起到了延緩成熟衰老的作用。目前，許多研究表明NO可通過(guò)與乙烯的拮抗作用來(lái)延緩果蔬成熟并提高果蔬貯藏過(guò)程中的抗逆性，改善采后品質(zhì)、延長(zhǎng)貨架期。Singh等[10]研究發(fā)現(xiàn)，10 μL/L的NO熏蒸日本李果實(shí)2 h，可顯著抑制21 ℃貯藏下果實(shí)的呼吸速率和乙烯釋放速率，并延緩果實(shí)遲熟3～4 d及其可滴定酸的下降。Han等[11]利用10 μL/L的NO熏蒸‘霞暉6號(hào)’桃果實(shí)3 h并置于4 ℃下24 d，與對(duì)照相比，處理果實(shí)乙烯的釋放速率顯著降低且保持較高硬度，NO處理還提高了果實(shí)蔗糖磷酸合成酶的活性，使貯藏期間的果實(shí)在延緩衰老的同時(shí)仍保持了較高的蔗糖含量。NO也能在非呼吸躍變型果蔬成熟的過(guò)程中發(fā)揮作用。Zhao等[12]利用20 μL/L外源NO熏蒸冬棗3 h并在0 ℃下貯藏75 d，結(jié)果表明，NO可顯著降低冬棗的失重率與腐爛率，使其保持較高的硬度和較低的呼吸速率，抑制丙二醛（MDA）含量和細(xì)胞膜通透性的增加，延緩冬棗衰老。300 μL/L的NO熏蒸葡萄2 h，可減輕0 ℃下貯藏葡萄ROS的積累和膜脂過(guò)氧化程度，貯藏結(jié)束時(shí)，處理果實(shí)的失重率和和褐變指數(shù)分別比對(duì)照低133.82%和34.20%[13]。

除NO氣體外，也可利用硝普鈉（SNP）作為外源NO供體。以0.2 mmol/L的SNP浸泡處理獼猴桃10 min并置于20 ℃下貯藏，可有效延緩貯藏期間獼猴桃果實(shí)硬度和維生素C（VC）含量的下降，抑制可溶性固形物（SSC）的上升和可滴定酸（TA）的下降速率，降低代謝強(qiáng)度，有效延緩其成熟，有利于果實(shí)品質(zhì)的保持[14]?！_(tái)農(nóng)’芒果經(jīng)0.25 mmol/L的SNP浸泡2 min后，可有效抑制呼吸速率和失重率、保持硬度、延緩顏色轉(zhuǎn)變，使其保持良好的果品品質(zhì)[15]。有關(guān)內(nèi)源NO在果蔬成熟過(guò)程的作用也有所研究，15 kJ/m2的UV-B照射處理芒果4 h后，可提高果實(shí)在6 ℃冷藏期間內(nèi)源性NO的含量，令其保持較高的硬度并減少冷害[16]。

果蔬成熟過(guò)程中，NO在很大程度上調(diào)節(jié)包括乙烯在內(nèi)的多種植物激素的活性。無(wú)論是外源施用NO還是提高內(nèi)源性NO，都能起到延緩果蔬成熟衰老的作用。對(duì)于常溫貯藏的果蔬，NO能降低呼吸強(qiáng)度與乙烯釋放速率以延緩成熟，延長(zhǎng)貨架期并保持良好的品質(zhì)。對(duì)于低溫貯藏的果蔬，NO可通過(guò)提高抗氧化能力使其產(chǎn)生良好的抗逆性，降低氧化損傷并減少冷害。

1.2 延緩果蔬成熟機(jī)理

NO是一種有效調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)分子且具有雙重影響，低濃度的NO幫助植物延緩衰老并抵御脅迫，高濃度則抑制生長(zhǎng)，加速衰老[8]。植物組織中，NO可通過(guò)質(zhì)外體作用于細(xì)胞壁組分，NO氧化產(chǎn)生的自由基（NO·、NO+、NO）可與細(xì)胞壁組分作用促進(jìn)細(xì)胞的擴(kuò)展，進(jìn)而促進(jìn)生長(zhǎng)[17]。隨濃度升高，NO進(jìn)一步作用于細(xì)胞膜的磷脂雙分子層，增強(qiáng)膜的流動(dòng)性；當(dāng)NO濃度更高時(shí)，它會(huì)與過(guò)氧亞硝酸鹽、超氧陰離子作用導(dǎo)致膜滲漏，甚至還會(huì)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，攻擊關(guān)鍵酶類加速組織衰老[17]。

乙烯是植物體內(nèi)的重要激素，從果實(shí)的成熟與軟化到葉片的衰老等都受其調(diào)控。乙烯的生物合成過(guò)程包括兩步驟（圖1）[1]。如圖1所示，NO對(duì)乙烯代謝的調(diào)節(jié)存在三個(gè)作用位點(diǎn)。首先，NO可對(duì)SAM合成酶（SAMS）的蛋白質(zhì)巰基進(jìn)行可逆的S-亞硝基化修飾而令其失活[18]，進(jìn)而抑制SAM的合成并使乙烯產(chǎn)量減少。Lindermayr等[19]曾對(duì)擬南芥進(jìn)行了全面的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，鑒定了100多個(gè)S-亞硝基化蛋白，其中包括甲硫氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（MAT）。Lindermayr等[18]根據(jù)上述結(jié)果進(jìn)行了相關(guān)分子機(jī)制的研究，發(fā)現(xiàn)在擬南芥主導(dǎo)S-腺苷甲硫氨酸（SAM）生物合成的三種MAT亞型（MAT1-MAT3）中，只有在Cys-114位的MAT1蛋白質(zhì)巰基亞S-硝基化修飾才會(huì)引起SAMS活性的抑制。NO可以通過(guò)降低乙烯合成兩個(gè)關(guān)鍵的限速酶——ACC合成酶（ACS）和ACC氧化酶（ACO）活性來(lái)抑制乙烯的生物合成，進(jìn)而調(diào)控成熟與衰老進(jìn)程[5]。如利用15 μL/L的NO熏蒸‘Dahong’桃果實(shí)20 min，可通過(guò)降低ACS和ACO的活性來(lái)抑制乙烯的生物合成，保持果實(shí)品質(zhì)[20]。有關(guān)NO抑制乙烯合成的機(jī)制也有不同的解釋。10 μL/L的NO熏蒸‘霞暉5號(hào)’桃果實(shí)3 h并置于室溫下貯藏，該處理使SAMS活性上調(diào)并促進(jìn)SAM和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（ACC）的積累，導(dǎo)致ACC-ACO-NO三元復(fù)合體的形成，最終抑制乙烯的生物合成[21]。Lv等[22]利用擬南芥探究了NO和乙烯在其葉片衰老中的相互作用關(guān)系，結(jié)果表明NO的積累阻止了ACS1誘導(dǎo)的葉片衰老發(fā)生。

圖1 植物乙烯合成途徑與甲硫氨酸循環(huán)Fig.1 Ethylene biosynthesis pathway and methionine recycling in plants

近期許多研究表明，果實(shí)成熟期間H2S和褪黑素也可以參與到NO和乙烯的相互作用之中。根據(jù)外源施用量的不同，NO和H2S之間既能產(chǎn)生協(xié)同作用也能發(fā)生拮抗作用，但NO-H2S在抑制乙烯誘導(dǎo)的果實(shí)成熟方面主要表現(xiàn)出協(xié)同作用[5]。Zhu等[20]比較了NO（15 μL/L、20 min）和H2S（20 μL/L、20 min）復(fù)合處理‘Dahong’桃果實(shí)與NO/H2S單獨(dú)處理延緩果實(shí)成熟的效果，復(fù)合處理較單獨(dú)處理顯著降低了ACC含量、ACS和ACO活性，抑制水溶性和環(huán)己二胺四乙酸（EDTA）溶性細(xì)胞壁組分的增加，延緩Na2CO3溶性組分的下降，降低果實(shí)軟化相關(guān)酶的活性，二者之間存在協(xié)同作用，通過(guò)抑制乙烯生物合成和細(xì)胞壁降解維持果品品質(zhì)。類似的協(xié)同效應(yīng)在草莓中也有發(fā)現(xiàn)，H2S（0.8 mmol/L NaHS溶液）和NO（5 μmol/L SNP 溶液）復(fù)合處理顯著抑制了草莓的呼吸速率和腐爛，增加了幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性，使草莓保持了較高的硬度及抗病性[23]。有關(guān)褪黑素與NO在果蔬成熟期間的相互作用在梨中有報(bào)道。Liu等[24]研究了外源施用褪黑素和NO對(duì)三種不同品種歐洲梨成熟和軟化的影響，將不同品種的梨分別浸泡在SNP溶液（100 μmol/L）、褪黑素溶液（100 μmol/L）、L-NAME溶液（200 μmol/L）及褪黑素（100 μmol/L）+ L-NAME溶液（200 μmol/L）中各12 h，結(jié)果表明，褪黑素和SNP處理均降低了果實(shí)纖維素酶基因（PcCel）和多聚半乳糖醛酸酶基因（PcPG）的表達(dá)，抑制了乙烯合成相關(guān)基因（PcACS和PcACO）的表達(dá)，并降低了呼吸和乙烯的產(chǎn)生速率，但其他兩種處理無(wú)顯著效果。通過(guò)比較上述四種處理結(jié)果發(fā)現(xiàn)，褪黑素可通過(guò)上調(diào)NO合酶基因（PcNOS）的表達(dá)提高NOS的活性，增加NO含量；但當(dāng)NO合成受到抑制時(shí)，褪黑素對(duì)果實(shí)成熟衰老的延緩作用幾乎被消除。

綜上，NO處理與延緩果蔬成熟存在著一定的劑量關(guān)系。NO可通過(guò)抑制SAMS、ACS以及ACO的活性來(lái)抑制乙烯的生物合成。其他因子如H2S和褪黑素也參與了NO與乙烯的互作并發(fā)揮了一定作用。

2 NO對(duì)果蔬冷害的影響

2.1 增強(qiáng)果蔬耐冷性

低溫貯藏是果蔬采后常用的一種保鮮方法，可用于保持果蔬采后品質(zhì)并延緩其衰老，延長(zhǎng)貨架期。然而，對(duì)低溫敏感的果蔬，冷藏期間往往伴隨冷害現(xiàn)象的發(fā)生，微觀結(jié)構(gòu)上會(huì)使細(xì)胞中的線粒體和葉綠體產(chǎn)生功能紊亂和腫脹，葉綠體內(nèi)脂滴積累以及染色質(zhì)聚集，細(xì)胞膜滲透性增加；宏觀上則會(huì)令果蔬表皮呈現(xiàn)凹陷和水漬狀、發(fā)生褐變，降低果蔬品質(zhì)[25]。與冷害相關(guān)的癥狀，可施用外源NO緩解。有報(bào)道稱，50 μmol/L的SNP溶液噴淋‘G.H. Hill’桃果實(shí)，可減輕4 ℃貯藏條件下桃的冷害，該處理主要通過(guò)減少貯藏期間活性氧的積累，增強(qiáng)抗氧化活性來(lái)減輕果實(shí)的氧化損傷，并抑制了乙烯產(chǎn)生、保持硬度及VC含量[26]。研究發(fā)現(xiàn)，采用0.5 mmol/L的SNP浸泡臍橙5 min并置于3 ℃貯藏，能夠提高果實(shí)SOD、POD、CAT等抗氧化酶的活性，降低果皮中脂質(zhì)過(guò)氧化程度和過(guò)氧化氫（H2O2）含量，維持細(xì)胞膜的完整性以提高果實(shí)的耐冷性[27]。以0.07 mmol/L的SNP中浸泡竹筍30 min并在1 ℃貯藏56 d，竹筍的丙二醛（MDA）含量和冷害發(fā)生率分別比對(duì)照降低了8.8%和37.9%，冷害程度明顯減輕[28]。

低溫貯藏可能還會(huì)造成果蔬成熟受阻以及風(fēng)味喪失等問(wèn)題。Cai等[29]研究了10 μL/L的NO熏蒸‘霞暉6號(hào)’桃果實(shí)3 h，對(duì)桃低溫（4 ℃）和常溫貨架期（20 ℃）貯藏過(guò)程中果實(shí)品質(zhì)和香氣物質(zhì)的影響，結(jié)果表明，NO處理增加了冷藏后果實(shí)主要香氣物質(zhì)（C6醛、C6醇、直鏈酯和內(nèi)酯）的排放，減輕了處理組果實(shí)冷害的發(fā)生（比對(duì)照組平均低20%），并促進(jìn)了處理組果實(shí)在常溫貨架期呼吸速率和乙烯生成量的恢復(fù)。

國(guó)內(nèi)外有關(guān)施用外源NO減輕果蔬冷害的研究較多，表1總結(jié)了外源NO處理對(duì)不同類型果蔬冷藏期間生理特性、抗氧化系統(tǒng)和ROS代謝的影響，兩種代謝主要涉及到等活性氧和VC、GR、酚類等抗氧化物質(zhì)，以及SOD、CAT、APX等酶。

2.2 NO抑制采后冷害的機(jī)理

關(guān)于NO抑制果蔬采后冷害，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者從分子生物學(xué)的角度出發(fā)、應(yīng)用基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組、代謝組學(xué)等技術(shù)開(kāi)展了大量的研究，初步揭示了NO增強(qiáng)果蔬抗冷性的機(jī)制。

2.2.1 激活抗氧化體系 活性氧自由基的積累和爆發(fā)是引起果蔬采后發(fā)生冷害的主要原因，果蔬在遭受低溫脅迫后會(huì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，最終干擾生物膜的結(jié)構(gòu)與功能誘發(fā)冷害產(chǎn)生[25]。能夠引起果蔬冷害發(fā)生的主要自由基包括及·OH等[26]。果蔬中存在著酶和非酶的自由基清除系統(tǒng)，活體果蔬組織中最重要的ROS清除酶系統(tǒng)成員包括SOD、APX、CAT、POD和GR等酶類[6]。表1可見(jiàn)，通過(guò)適宜濃度的NO或SNP處理，可顯著提高抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的活性，從而增強(qiáng)果蔬組織的氧化應(yīng)激能力并減輕冷害。Zhang等[31]利用60 μL/L的NO熏蒸哈密瓜3 h，探究了在低溫（1±0.5）℃貯藏下NO提高果實(shí)抗冷性的機(jī)理，發(fā)現(xiàn)NO大大提高了處理果實(shí)抗氧化系統(tǒng)酶（SOD、CAT、APX和POD）的活性，貯藏結(jié)束時(shí)處理果實(shí)的SOD活性比對(duì)照高53.42%，相應(yīng)的含量也顯著降低。NO增強(qiáng)抗氧化酶活性的作用可能是通過(guò)S-亞硝基化產(chǎn)生的，研究表明，NO可使APX1的第32位半胱氨酸發(fā)生S-亞硝基化從而增強(qiáng)該酶的活性，以提高植物將H2O2還原成H2O的速度[33]。除上述直接的酶促抗氧化系統(tǒng)外，植物體內(nèi)還存在著間接的抗氧化系統(tǒng)，如抗壞血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)。10 μL/L NO熏蒸桃果實(shí)3 h，顯著提高了果實(shí)低溫貯藏期間AsA/DHA比值（貯藏第3周為對(duì)照的3.3倍），同時(shí)在貯藏2周后，處理果實(shí)的總谷胱甘肽和還原型谷胱甘肽顯著增加，GR活性顯著增強(qiáng)，NO處理促進(jìn)冷藏期間桃果實(shí)ASA-GSH循環(huán)的再生機(jī)制，減輕桃果實(shí)的冷害與衰老[7]。

表1 NO處理對(duì)呼吸躍變型和非呼吸躍變型果蔬生理特性及氧化代謝的影響Table 1 Effects of NO treatment on physiological traits and oxidative metabolism in some climacteric and non-climacteric fruit and vegetables

2.2.2 維持能量水平 低溫脅迫條件下，果蔬組織的ATP合成受阻、能量下降，令細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞、生物膜功能損傷，同時(shí)也影響果蔬自身的活性氧清除功能[25]。植物體的耐冷性與其能量高低有關(guān)，維持較高的能量水平有利于降低冷藏的危害[34]。Wang等[35]研究了不同成熟階段的‘紅陽(yáng)’獼猴桃在0 ℃冷藏下的冷害情況，結(jié)果表明，高成熟度果實(shí)有著更高的抗氧化能力以及能量水平，且H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、琥珀酸脫氫酶（SDH）和細(xì)胞色素C氧化酶（CCO）等與能量代謝有關(guān)的酶活力顯著增強(qiáng)，減輕了冷害的發(fā)生。有文獻(xiàn)報(bào)道，用0.05 mmol/L的SNP處理香蕉并在7 ℃下貯藏20 d，處理香蕉的ATP含量和能荷顯著高于對(duì)照，且與能量代謝有關(guān)的H+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、SDH和CCO活性較對(duì)照顯著增強(qiáng)，果糖激酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的活性也顯著提高，說(shuō)明NO可通過(guò)維持冷藏期間果實(shí)內(nèi)較高的能量狀態(tài)和提高能量代謝相關(guān)酶的活性來(lái)提高果實(shí)的耐冷性[36]。另有報(bào)道稱，將‘肥城’桃果實(shí)置于15 mmol/L的NO溶液中浸泡10 min后，可顯著抑制桃果實(shí)0 ℃冷藏期間ATP、ADP、能荷含量及能量代謝酶活性的降低，延緩膜脂過(guò)氧化過(guò)程，提高果實(shí)的抗冷性[37]。

2.2.3 保護(hù)細(xì)胞膜 細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變是植物發(fā)生低溫冷害時(shí)最初的反應(yīng)。受到低溫脅迫后，細(xì)胞膜會(huì)發(fā)生由液晶態(tài)向凝膠態(tài)的膜相變，膜脂的不飽和脂肪酸含量下降，隨后膜的通透性增加，與細(xì)胞膜穩(wěn)定性相關(guān)的酶活性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的紊亂，如細(xì)胞膨壓?jiǎn)适?，?xì)胞液化，胞質(zhì)流動(dòng)性減少，最終造成冷害[34]。提高膜脂不飽和脂肪酸的含量可增加細(xì)胞膜的流動(dòng)性，從而提高果蔬的耐冷性。關(guān)于耐冷性與不飽和脂肪酸含量的關(guān)系在多種果蔬中均有報(bào)道。以10 μL/L的NO處理肥城桃，可通過(guò)增加線粒體膜及細(xì)胞膜不飽和脂肪酸（如亞麻酸、亞油酸）含量，來(lái)維持膜組織較低的相變溫度以減少膜組織損傷，維持細(xì)胞膜的流動(dòng)性及果實(shí)耐冷性[38]。Li等[39]用0.1 mmol/L的SNP處理生姜幼苗，處理幼苗的保持了較高的不飽和脂肪酸含量，特別是C16:1、C18:2和C18:3的含量顯著增高，提高了植株的耐冷性。MDA是脂膜過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，它會(huì)損傷生物膜結(jié)構(gòu)，改變膜的通透性，進(jìn)而損傷細(xì)胞。Wu等[30]利用60 μL/L的NO熏蒸香蕉3 h，該處理提顯著降低了香蕉在低溫冷藏期間MDA的含量，并減少了組織的電解質(zhì)滲漏率，使香蕉保持了更好的果品品質(zhì)。其他相似的結(jié)果在桃[7]、冬棗[12]和黃瓜[32]中也有所發(fā)現(xiàn)。

2.2.4 CBF抗冷途徑 冷害誘導(dǎo)的相關(guān)抗冷基因表達(dá)研究中，CBF（C-repeat binding transcription）抗冷途徑被認(rèn)為是最關(guān)鍵的一條低溫響應(yīng)調(diào)控途徑。CBF調(diào)控著下游抗冷基因的表達(dá)：植物細(xì)胞膜上的受體感受到環(huán)境的低溫信號(hào)并將其傳送至細(xì)胞核，Ca2+和MAPKs等感知和傳導(dǎo)該信號(hào)，激活相關(guān)酶類并誘導(dǎo)CBF轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，從而啟動(dòng)冷誘導(dǎo)功能基因（COR）的表達(dá)，觸發(fā)冷響應(yīng)答[37]。Costa-Broseta等[40]通過(guò)野生型擬南芥與三倍突變體nia1nia2noa1-2擬南芥在4 ℃時(shí)CBF基因相對(duì)表達(dá)量的對(duì)比得出，NO的積累能顯著提高低溫條件下擬南芥CBF基因的表達(dá)量。利用60 μL/L的NO處理哈密瓜，在冷藏期間與對(duì)照組相比，哈密瓜的CmCBF1和CmCBF3表達(dá)量顯著提高，減輕哈密瓜的冷害[31]。Jiao等[41]用15 mmol/L的SNP浸泡處理‘金秋紅蜜’桃果實(shí)10 min，并研究了CBF基因在其4 ℃貯藏期間的表達(dá)情況，結(jié)果表明，處理果實(shí)的CBF的相對(duì)表達(dá)量（5.9）在冷藏第21 d達(dá)到最大值，是對(duì)照的2.9倍，該處理顯著降低了果實(shí)的冷害指數(shù)。以15 mmol/L的NO溶液中浸泡10 min的‘肥城’桃置于0 ℃冷藏，果實(shí)CBF家族基因的熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，冷藏期間處理桃果實(shí)CBF1/5/6基因表達(dá)量較對(duì)照升高迅速，且均維持在較高的水平，說(shuō)明NO能通過(guò)上調(diào)CBF轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量來(lái)提高植物抗冷能力[37]。

以上研究結(jié)果提示，NO主要通過(guò)激活果蔬組織抗氧化系統(tǒng)來(lái)減輕氧化應(yīng)激的傷害、維持較高能量水平及降低脂膜的過(guò)氧化程度，從而保持細(xì)胞的完整性和誘導(dǎo)CBF抗冷基因表達(dá)，激活果蔬組織對(duì)低溫的響應(yīng)，減輕冷害癥狀，并保持良好的品質(zhì)性狀。

3 NO對(duì)果蔬抗病性的影響

3.1 提高果蔬抗病性

采后果蔬貯藏期間易受到病原菌（主要是真菌）的侵染而造成腐爛變質(zhì)，這是導(dǎo)致果蔬采后大量損耗的重要因素之一。大量的研究結(jié)果表明，NO在抑制果蔬侵染性病害方面有著積極的作用，表2總結(jié)了NO處理對(duì)不同類型果蔬抗病性的影響。

表2 NO處理對(duì)呼吸躍變型和非呼吸躍變型果蔬抗病性的影響Table 2 Interactions between NO and the defense responses of some climacteric and non-climacteric fruit and vegetables

Yan等[44]研究了60 μL/L NO熏蒸甜瓜對(duì)采后黑斑病的防治效果，NO處理明顯降低了接種鏈格孢菌（Alternaria alternata）甜瓜果實(shí)的病斑直徑（減小了23.25%）和病斑深度（減小了9.67%），網(wǎng)紋組織中菌絲的數(shù)量也明顯減少，提高了果實(shí)的抗病性。研究表明，利用100 μL/L NO熏蒸接種了粉紅單端孢（Trichotheciu roseum）的哈密瓜2 h，可降低貯藏21 d中處理果實(shí)的發(fā)病率，且NO能夠抑制病斑直徑的擴(kuò)大，降低細(xì)胞薄膜滲透率，使處理果實(shí)保持較高的硬度[48]。炭疽病是柑橘果實(shí)貯藏中常見(jiàn)的病害之一，Zhou等[46]利用50 μmol/L的SNP溶液浸泡甜橙10 min后對(duì)其進(jìn)行病原菌接種，結(jié)果表明，外源NO處理顯著降低了由C. gloeosporioides引起的炭疽病發(fā)生，且20 ℃貯藏28 d后處理果實(shí)的病斑直徑減小了（僅為對(duì)照的）40.58%。將NO應(yīng)用在獼猴桃中也能抑制獼猴桃灰霉病和軟腐病的發(fā)生[45]。

3.2 提高抗病性的機(jī)理

NO作為一種化學(xué)激發(fā)因子能夠通過(guò)多種途徑誘導(dǎo)果蔬的抗病性，現(xiàn)有文獻(xiàn)的研究表明其作用機(jī)理包括以下幾方面。

3.2.1 殺傷病原菌 新鮮果蔬正常細(xì)胞中的活性氧會(huì)處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)，但其在受到病原菌侵染后活性氧便會(huì)大量積累，NO則會(huì)和活性氧中的反應(yīng)生成過(guò)氧亞硝酸陰離子（ONOO-）。ONOO-是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，可使核酸亞硝?；⒘頓NA斷裂，也可與酶的Fe-S中心結(jié)合抑制酶活性，對(duì)蛋白質(zhì)、脂類都有很強(qiáng)的破壞作用[49]。因此，果蔬遭受病原菌侵染后，生成的ONOO-可直接殺死病原菌，從而提高自身的抗病性。Gaupels等[50]用攜帶AvrB無(wú)毒基因的病原體感染擬南芥，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，被感染的擬南芥產(chǎn)生了大量的ONOO-以提高機(jī)體的抗病性。

NO還具有提高ROS清除系統(tǒng)酶活性的作用，可避免ROS過(guò)量積累對(duì)膜脂產(chǎn)生過(guò)氧化作用。利用60 μL/L的NO熏蒸香蕉3 h可提高香蕉中各類抗氧化酶（SOD、CAT、APX和POD）的活性，處理果實(shí)中的顯著降低，且保持了更低的MDA含量和電解質(zhì)滲漏率[30]。Abramowski等[51]利用致病疫霉（Phytophthora infestans）無(wú)毒小種（avr）和致病小種（vr）分別感染馬鈴薯葉片，結(jié)果顯示，非親和互作中葉片早期產(chǎn)生的和NO會(huì)反應(yīng)生成大量ONOO-，同時(shí)SOD活性也顯著提高，增強(qiáng)葉片對(duì)病原菌的防御。

3.2.2 苯丙烷代謝 苯丙烷代謝是果蔬采后抗病的重要途徑之一，該代謝過(guò)程可產(chǎn)生重要的抗菌物質(zhì)木質(zhì)素，木質(zhì)素可以保護(hù)細(xì)胞壁不受病原菌分解并阻礙病原菌擴(kuò)散，能夠抑制真菌生長(zhǎng)[52]。合成木質(zhì)素的各前體物質(zhì)（如阿魏酸、松柏醇、咖啡酸等）也有抑菌效果。丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羥基化酶（C4H）、4-香豆酸-CoA-連接酶（4CL）和查爾酮異構(gòu)酶（CHI）等為苯丙烷代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶。其中PAL與類黃酮和木質(zhì)素的積累有關(guān)，C4H與咖啡酸、阿魏酸等前體物質(zhì)的合成相關(guān)，4CL能夠催化各種CoA酯合成；CHI是異黃酮合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶。因此，苯丙烷代謝過(guò)程中關(guān)鍵酶的活性可以作為果蔬抗病性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一[44]。Li等[43]研究了NO誘導(dǎo)桃果實(shí)抗病性與苯丙烷途徑的關(guān)系，15 μmol/L的NO溶液浸泡處理果實(shí)后，PAL、C4H、4CL和CHI的活性及基因表達(dá)均顯著提高，苯丙烷代謝產(chǎn)物木質(zhì)素、總酚和類黃酮的含量也顯著增加。另外，NO處理對(duì)接種炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的芒果[42]和火龍果[47]也可增強(qiáng)苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶活性，并增加木質(zhì)素等物質(zhì)的積累，抑制果實(shí)上病原菌的生長(zhǎng)，增強(qiáng)其抗病性。

3.2.3 病程相關(guān)蛋白和抗病基因的表達(dá) 病程相關(guān)蛋白（PRs）受病原菌或其他外界因子的脅迫而誘導(dǎo)表達(dá)，是植物在病理或病理相關(guān)的環(huán)境下產(chǎn)生的一類可以參與植物防御的蛋白，根據(jù)血清關(guān)系和生物學(xué)活性可將其分為17個(gè)家族（PR1-PR17）[53]。一些具有酸性特征的PR位于胞間，在組織滲透之前作用于入侵的病原菌；另一些堿性蛋白則是位于液泡之中，可以在組織損傷后發(fā)揮作用[53]。目前研究比較透徹的PRP主要包括幾丁質(zhì)酶（CHT）和β-1,3-葡聚糖酶（GLU）等。CHT和GLU能夠降解病原菌細(xì)胞的細(xì)胞壁，抑制真菌的生長(zhǎng)，兩種酶存在協(xié)同作用。Hu等[42]研究了外源施用SNP對(duì)‘貴妃’芒炭疽病的抑制效果，0.1 mmol/L SNP浸泡‘貴妃’芒果實(shí)5 min后能顯著提高期CHT、GLU以及苯丙烷代謝途徑相關(guān)酶的活性，降低了果實(shí)發(fā)病率和病斑直徑。其它有關(guān)NO處理提高CHT和GLU活性的研究詳見(jiàn)表2。Gu等[54]研究了NO溶液對(duì)桃果實(shí)褐腐病的防治效果，15 μmol/L的NO溶液處理顯著減小了果實(shí)的發(fā)病率和病斑面積，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）分析顯示，PR-1和PR-10兩個(gè)基因在NO處理組均表達(dá)上調(diào)。近年來(lái)，學(xué)者們對(duì)植物抗病相關(guān)的酶基因的研究越來(lái)越多，通常采后果蔬抗病性的強(qiáng)弱與這些基因的表達(dá)量呈正相關(guān)。利用NO對(duì)獼猴桃果實(shí)處理的研究中，有關(guān)抗病酶的基因AdPAL、AdPOD和AdCHT的表達(dá)均顯著提高，獼猴桃的抗病性在室溫貯藏條件下增強(qiáng)[45]。

因此，NO誘導(dǎo)采后果蔬抗病性主要通過(guò)與O2-反應(yīng)生成的ONOO-來(lái)殺傷病原菌、激活苯丙烷代謝相關(guān)酶類的活性以及誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白和抗病基因的表達(dá)來(lái)提高果蔬組織的抗病性。

4 展望

關(guān)于NO對(duì)果蔬生理和品質(zhì)方面的影響，國(guó)內(nèi)外的學(xué)者已經(jīng)做了大量的研究，取得了較為顯著的成果，但對(duì)NO延緩果蔬成熟衰老、提高抗性作用的相關(guān)機(jī)制研究還不全面和深入，僅局限于果蔬的生理和新陳代謝等方面，分子層面的機(jī)理了解不多。今后的研究可利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等方法進(jìn)行研究，這將有助于、充分理解NO在果蔬體內(nèi)的作用機(jī)理。另外，關(guān)于NO在果蔬體內(nèi)的相關(guān)作用位點(diǎn)尚不清楚，可借助基因編輯的方法（如CRISPR/Cas9）來(lái)找到相關(guān)作用的靶點(diǎn)，并應(yīng)用到未來(lái)的優(yōu)良品種的育種工作中。雖然利用NO處理果蔬在實(shí)驗(yàn)室中的技術(shù)比較成熟，但商業(yè)實(shí)踐中利用NO氣體處理大規(guī)模的果蔬產(chǎn)品還存在許多問(wèn)題（比如NO易被氧化成NO2、價(jià)格昂貴等），阻礙其NO的商業(yè)推廣。因此，需要找尋穩(wěn)定的NO釋放劑或其替代品，比如經(jīng)濟(jì)且易于處理的天然來(lái)源的NO誘導(dǎo)劑。