葡萄糖酸內(nèi)酯酸化處理對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠特性的影響

向晨曦，徐新星，劉 康，李鈺金，高瑞昌，白 帆，汪金林, ，趙元暉,

（1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.衢州鱘龍水產(chǎn)食品科技開發(fā)有限公司，浙江衢州 324004）

鱘魚是一種體型較大的淡水魚類，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和科研價(jià)值[1]。鱘魚肉富含蛋白質(zhì)和多不飽和脂肪酸，其中8種人體必需氨基酸配比均衡，營養(yǎng)非常豐富[2]。此外，鱘魚肉厚骨軟[3]，非常適合用來制作魚糜。魚糜是以海水魚或淡水魚為原料經(jīng)過一系列加工制成的一種高蛋白、低脂肪、低膽固醇的水產(chǎn)食品，由于其營養(yǎng)健康、風(fēng)味獨(dú)特深受消費(fèi)者青睞[4]。在傳統(tǒng)魚糜制作過程中，漂洗是其中最重要的步驟之一，它可以去除魚肉中的水溶性蛋白質(zhì)、色素、氣味、脂肪以及無機(jī)離子等成分，從而提高魚糜的凝膠強(qiáng)度和白度[5]。但同時(shí)漂洗出的蛋白和脂肪會(huì)造成營養(yǎng)物質(zhì)大量流失及產(chǎn)率降低，漂洗后的廢水也會(huì)引起環(huán)境污染，且操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力[6]。因此，有必要開發(fā)未漂洗魚糜產(chǎn)品解決上述問題。

葡萄糖酸內(nèi)酯（GDL）是一種蛋白凝固劑，可水解釋放葡萄糖酸，使體系pH降低，從而減弱蛋白分子間的靜電斥力，在低溫下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集形成凝膠[7]。GDL添加量為2.4%可獲得品質(zhì)較高的羅非魚碎肉蛋白凝膠[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在低溫條件下GDL可誘導(dǎo)肌肉蛋白形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[9]。但目前關(guān)于GDL對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠特性影響鮮有報(bào)道。

本研究中以未漂洗鱘魚糜為原料，探究在低溫交聯(lián)過程中不同GDL添加量對(duì)魚糜凝膠化學(xué)作用力及膠凝特性的影響，以期為提高未漂洗淡水魚糜品質(zhì)和開發(fā)新型魚糜制品提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮鱘魚（施氏鱘和西伯利亞鱘雜交幼年鱘，體質(zhì)量（1.5～2 kg） 購買于青島市城陽區(qū)水產(chǎn)養(yǎng)殖公司；食鹽 食品級(jí)，青島金貝歐公司；山梨糖醇、三聚磷酸鈉、葡萄糖酸內(nèi)酯 食品級(jí)，河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；氯化鈉、尿素、硫酸銅、氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、碳酸鈉、十二烷基硫酸鈉（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、2-硝基苯甲酸（DTNB）、考馬斯亮藍(lán)R-250 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Tris 分析純，美國Sigma公司。

TJ12-H絞肉機(jī) 廣東恒聯(lián)食品機(jī)械有限公司；FMB40雪花制冰機(jī) 上海冠森生物科技有限公司；NR60CP手持式色差儀 深圳市三恩馳科技有限公司；TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀 美國Food Technology公司；FJ-200高速均質(zhì)機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；VL-5B高速離心機(jī) 湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；LG10-3A冷凍離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 未漂洗魚糜的制備 將新鮮的鱘魚用力擊暈，然后去掉魚頭、魚內(nèi)臟和魚皮，取下魚肉切成小塊，用冰水將小塊魚肉沖洗干凈并放在碎冰上保持低溫，再將魚肉置于絞肉機(jī)（孔板直徑為3 mm）中絞2～3遍。然后絞碎的魚糜不經(jīng)過漂洗、脫水等步驟，直接添加傳統(tǒng)抗凍劑（0.25%三聚磷酸鈉和4%山梨醇）并混合均勻，即為未漂洗鱘魚糜（水分含量為76.67%±0.19%）。最后將魚糜分裝進(jìn)自封袋中（每袋300 g），放在-20 ℃下冷凍待用。

1.2.2 未漂洗魚糜凝膠的制備 將冷凍魚糜從冰箱取出并在4 ℃下解凍，空擂2 min，然后加入1.5%食鹽（以冷凍魚糜重量計(jì)，下同）、不同添加量（0%、1%、2%、3%和4%）的GDL及冰水繼續(xù)擂潰2 min，魚糜中水分含量在80%左右。最后在4 ℃下放置24 h形成凝膠。

1.2.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.2.3.1 pH的測(cè)定 取5.0 g樣品，加入50 mL去離子水，均質(zhì)30 s后靜置30 min，取上清液，使用pH計(jì)測(cè)定pH。

1.2.3.2 凝膠強(qiáng)度的測(cè)定 根據(jù)ZHANG等[10]的方法略作修改。使用質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行測(cè)定，參數(shù)設(shè)置如下：探頭選用直徑為5 mm的圓柱形探頭，起始力為0.05 N，測(cè)試速度為1 mm/s，穿刺距離為10 mm。測(cè)定魚糜的凝膠強(qiáng)度。每個(gè)樣品測(cè)定8個(gè)平行。

1.2.3.3 質(zhì)構(gòu)的測(cè)定 參照常莉莉等[11]的方法略作修改。使用質(zhì)構(gòu)分析儀進(jìn)行物性分析，參數(shù)設(shè)置如下：探頭選用直徑為35 mm的圓盤，起始力為0.05 N，測(cè)試速度為1 mm/s，形變量為40%，測(cè)定魚糜的硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性、膠黏性和粘附性。每個(gè)樣品測(cè)定8個(gè)平行。

1.2.3.4 持水性的測(cè)定 按照CAO等[12]的方法并稍作修改，稱取約1 g樣品（m1）用雙層濾紙包裹，置于離心管中。將離心管放入4 ℃的離心機(jī)中以5000 r/min離心10 min，離心后取出樣品稱量（m2）。每個(gè)樣品測(cè)定8個(gè)平行，按下列公式計(jì)算持水性：

1.2.3.5 白度的測(cè)定 將樣品放置在室溫下平衡30 min，采用手持色差儀進(jìn)行測(cè)定其L*（亮度）、a*（紅度）和b*（黃度），每個(gè)樣品測(cè)定8次，按照如下公式計(jì)算白度[13]：

1.2.3.6 化學(xué)作用力的測(cè)定 參照NI等[14]的方法并略作修改。取2 g魚糜樣品分別溶于10 mL SA（0.05 mol/L NaCl）、SB（0.6 mol/L NaCl）、SC（0.6 mol/L NaCl+1.5 mol/L尿素）和SD（0.6 mol/L NaCl+8 mol/L尿素）4種溶液中，均質(zhì)1 min，4 ℃下靜置1 h，以10000 r/min的轉(zhuǎn)速在4 ℃冷凍離心機(jī)中離心15 min，上清液中蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法測(cè)定。按照下列公式計(jì)算：

1.2.3.7 總巰基的測(cè)定 參考BENJAKUL等[15]的方法。取稀釋至2 mg/mL的蛋白樣品1 mL，加入0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含8 mol/L尿素，2% SDS，10 mmol/L EDTA，pH6.8）9 mL，混勻后取4 mL混合液加入0.4 mL的0.2 mol/L Tris-HCl緩沖液（含0.1% DTNB，pH8.0），在40 ℃水浴反應(yīng)25 min，于412 nm處測(cè)吸光度。使用蒸餾水作為空白對(duì)照。按如下公式計(jì)算總巰基含量：

式中：A為412 nm處的吸光度；V為稀釋倍數(shù)；ε為吸光系數(shù)，13600 mol·cm/L；c為蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

1.2.3.8 SDS-PAGE凝膠電泳 樣品經(jīng)前處理后，將樣品加載到電泳儀上，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，在80 V電壓下運(yùn)行30 min，然后在120 V電壓下運(yùn)行3 h左右。電泳結(jié)束后用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250對(duì)凝膠振蕩染色2 h，用醋酸-乙醇溶液脫色過夜[16]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS Statistics 24計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用Duncan多重檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性分析（P＜0.05)，并采用Origin 2017進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠pH的影響

魚糜凝膠pH隨GDL添加量變化的情況如圖1所示，不同濃度的GDL對(duì)魚糜凝膠的pH影響程度不同。魚糜不添加GDL時(shí)pH為6.54，由圖可知，當(dāng)GDL添加量逐漸增加，pH呈顯著降低的趨勢(shì)（P＜0.05），分別為5.48、4.76、4.35和4.02。這是由于GDL是一種弱酸酸化劑，易溶于水，可以水解產(chǎn)生葡萄糖酸，從而使得魚糜凝膠的pH迅速下降。

圖1 不同GDL添加量下魚糜凝膠pH的變化Fig.1 Changes in pH of surimi gel under different GDL addition amounts

2.2 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠強(qiáng)度的影響

凝膠強(qiáng)度可反映蛋白質(zhì)凝膠內(nèi)部結(jié)構(gòu)的牢固程度[17]。如圖2所示，當(dāng)GDL添加量從0%逐漸增加到3%時(shí)，魚糜凝膠強(qiáng)度呈增大趨勢(shì)，且在添加量為3%時(shí)最大。但是隨著添加量進(jìn)一步增加，其凝膠強(qiáng)度顯著降低（P＜0.05）。pH會(huì)影響蛋白質(zhì)分子的電荷性質(zhì)來影響蛋白質(zhì)分子的聚集[18]，因此凝膠強(qiáng)度出現(xiàn)這種先升后降的現(xiàn)象其原因可能是GDL分解產(chǎn)酸，較低的pH誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變形聚集形成強(qiáng)度較大的凝膠[19]，但是GDL過量添加會(huì)導(dǎo)致pH持續(xù)降低，蛋白質(zhì)分子表面電荷排斥作用加強(qiáng)，影響了蛋白聚集體的形成從而導(dǎo)致凝膠強(qiáng)度降低[20]。這與鄭嚴(yán)等[21]使用不同GDL添加量處理真鯛魚糜時(shí)得到的結(jié)果類似。ZHANG等[22]研究發(fā)現(xiàn)GDL通過調(diào)節(jié)pH改變了電荷和豬血漿蛋白（PPP）溶液的聚集狀態(tài)，并得出0.3%GDL和0.2%轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶共存時(shí)可誘導(dǎo)形成硬度良好的PPP冷固性凝膠的結(jié)論。由此可推斷適當(dāng)?shù)乃峄梢孕纬赡z性能優(yōu)異的魚糜凝膠。

圖2 不同GDL添加量下魚糜凝膠強(qiáng)度的變化Fig.2 Changes in gel strength of surimi under different GDL addition amounts

2.3 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

如表1所示，隨著GDL的增加，魚糜凝膠的硬度和彈性增大，較高添加量的GDL會(huì)誘導(dǎo)形成高強(qiáng)度的魚糜凝膠。硬度和彈性是反映魚糜口感的重要參數(shù)，主要與參與形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的力有關(guān)。硬度在添加量為3%時(shí)最大，為19.84±2.26 N，之后進(jìn)一步增加添加量對(duì)魚糜的硬度沒有產(chǎn)生明顯的影響。從彈性指標(biāo)來看，隨著添加量的增加，彈性呈現(xiàn)上下往復(fù)變化，與對(duì)照組相比，總體有所提高。這表明較高的GDL添加量可通過迅速降低pH來增加蛋白分子間的結(jié)合力。當(dāng)添加量從1%逐漸添加到4%時(shí)，內(nèi)聚性、咀嚼性和膠黏性均呈現(xiàn)先持續(xù)增大后保持穩(wěn)定的趨勢(shì)。黏附性隨著GDL的增加而顯著降低（P＜0.05），這是由于不添加GDL時(shí)為擂潰后的魚肉糊，探頭壓縮完與之分離時(shí)因?yàn)轲ば愿呤艿捷^大的牽引力，而添加GDL后魚糜凝膠的黏性下降，黏附性隨之降低。

表1 不同GDL添加量下魚糜凝膠質(zhì)構(gòu)的變化Table 1 Changes in texture of surimi gel under different GDL addition amounts

2.4 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠持水性的影響

持水性表示凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)保持水分的能力，同時(shí)也能夠在一定程度上反映出魚糜的凝膠狀況[23]。圖3 反映了GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠持水性的影響，與對(duì)照組相比，隨著GDL添加量的增加，魚糜凝膠的持水性基本呈先升高后下降的趨勢(shì)。當(dāng)添加量為2%和3%時(shí)持水性最好，分別為87.26%±0.96%和86.82%±0.97%，二者之間無顯著性差異（P＞0.05）。添加GDL后，酸誘導(dǎo)魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成，因此與對(duì)照組相比顯著提高了魚糜凝膠強(qiáng)度和持水性（P＜0.05），而另一方面可能是由于當(dāng)添加量逐漸增加，蛋白分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)逐漸暴露，疏水相互作用增大導(dǎo)致鎖水能力下降[24]，這兩方面綜合影響了持水性的變化。高宇等[25]研究也發(fā)現(xiàn)GDL的添加有利于提高羅非魚碎肉蛋白凝膠的持水性。

圖3 不同GDL添加量下魚糜凝膠持水性的變化Fig.3 Changes in water holding capacity of surimi gel under different GDL addition amounts

2.5 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠白度的影響

一般來說，魚糜凝膠的色澤會(huì)根據(jù)凝膠情況而表現(xiàn)出不同，白度越高表明魚糜制品品質(zhì)越高，越容易受到消費(fèi)者的喜愛。由表2可知，添加GDL后的魚糜凝膠白度顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且白度值隨著GDL添加量的增大而逐漸增大，但添加量超過3%時(shí)白度值變化不明顯。白度增加是蛋白變性的結(jié)果[21]，與對(duì)照組相比較，GDL的添加明顯提高了魚糜凝膠的亮度值（L*）和白度值，由此可以推斷出GDL影響了魚糜蛋白的結(jié)構(gòu)變化，增大了變性程度。此外，凝膠的白度值也會(huì)受到蛋白質(zhì)組成以及魚糜表面光學(xué)特性的影響[26]。

表2 不同GDL添加量下魚糜凝膠白度的變化Table 2 Changes in whiteness of surimi gel under different GDL addition amounts

2.6 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠化學(xué)作用力的影響

氫鍵、離子鍵和疏水相互作用等在魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮的重要作用[27]。從圖4中可以

看出，不添加GDL時(shí)魚糜蛋白分子間作用力主要包括離子鍵和氫鍵，疏水相互作用所占比例很小。隨著GDL含量的增加，氫鍵和離子鍵由于被破壞而逐漸降低，說明氫鍵和離子鍵不是維持GDL誘導(dǎo)魚糜凝膠結(jié)構(gòu)的主要化學(xué)作用力，而與對(duì)照組相比，疏水相互作用顯著增強(qiáng)（P＜0.05），這表明在GDL低溫誘導(dǎo)魚糜凝膠化的過程中形成了更多的疏水相互作用，因此疏水相互作用是維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要化學(xué)作用力。高宇等[25]認(rèn)為GDL酸處理使得蛋白變性，結(jié)構(gòu)展開，疏水基團(tuán)暴露從而形成疏水相互作用。而GDL添加量過高時(shí)，疏水相互作用減小，這與王琳[28]的研究結(jié)果相似，推測(cè)可能與蛋白質(zhì)構(gòu)下降有關(guān)。

2.7 不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠總巰基含量的影響

巰基是蛋白中反應(yīng)活性最強(qiáng)的功能集基團(tuán)，總巰基含量變化可間接反映二硫鍵變化，二硫鍵是維系凝膠體系的重要作用力[29]。由圖5可知，整體上來看總巰基含量隨GDL的增加呈先下降后升高的趨勢(shì)，總巰基的減少是由于二硫鍵的形成，GDL降低了魚糜凝膠的pH，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性引起結(jié)構(gòu)變化，暴露出的游離巰基被氧化形成了二硫鍵[7]，說明在酸誘導(dǎo)魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的過程中也有少量二硫鍵的參與。但從圖中可知，當(dāng)GDL含量進(jìn)一步增加至3%以上時(shí)總巰基含量升高，因此pH過低不利于二硫鍵的形成，在許艷順[20]的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)論。

圖5 不同GDL添加量下魚糜凝膠總巰基含量的變化Fig.5 Changes in total sulfhydryl content of surimi gel under different GDL addition amounts

2.8 SDS-PAGE凝膠電泳分析

不同GDL添加量的未漂洗鱘魚糜凝膠的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果如圖6所示。肌球蛋白重鏈（MHC，220 kDa）、肌動(dòng)蛋白（AC，43 kDa）是魚糜凝膠中的主要蛋白質(zhì)，其中肌球蛋白是魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵蛋白[30]。從圖6中可以看出，與對(duì)照組相比，添加GDL后魚糜凝膠MHC條帶的強(qiáng)度呈現(xiàn)出一定程度的減弱，表明了肌球蛋白發(fā)生了變化，在酸化誘導(dǎo)魚糜凝膠的過程中MHC通過催化交聯(lián)形成了更多的ε-（γ-谷氨酰）賴氨酸鍵，從而提高了魚糜凝膠的質(zhì)構(gòu)特性[31]。AC條帶的強(qiáng)度隨著GDL添加量的增加逐漸減弱，但繼續(xù)增加GDL添加量AC條帶沒有明顯變化。楊明柳等[32]研究發(fā)現(xiàn)向鱖魚魚糜中添加谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶后MHC和AC條帶減弱，促進(jìn)了蛋白交聯(lián)。

圖6 不同GDL添加量下魚糜凝膠蛋白變化的電泳圖Fig.6 Electrophoresis patterns of surimi gel protein under different GDL addition amounts

3 結(jié)論

不同GDL添加量對(duì)未漂洗鱘魚糜凝膠特性的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，添加GDL后可以顯著提高未漂鱘魚糜凝膠的凝膠強(qiáng)度、硬度、咀嚼性、膠黏性、白度和持水性（P＜0.05），并且在添加量為3%時(shí)達(dá)到最大。過量GDL會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集受到影響從而減弱魚糜凝膠特性。在GDL酸化誘導(dǎo)魚糜凝膠過程中，疏水相互作用是維持魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要作用力。總巰基含量和SDSPAGE凝膠電泳結(jié)果表明二硫鍵的增加和蛋白質(zhì)共價(jià)交聯(lián)程度的提高促進(jìn)了魚糜凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。綜上，GDL添加量為3%時(shí)可獲得品質(zhì)較好的魚糜凝膠。這項(xiàng)研究為開發(fā)低溫凝膠化魚糜制品提供了重要理論支撐。