15味中草藥水煎劑對(duì)狐源O1型腸外致病性大腸桿菌體外抑菌效果

馮 嶺 劉勃興 趙安奇 史秋梅*

(1.樂(lè)亭縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，唐山，063000；2.河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，秦皇島，066004)

在狐(Vulpes)飼養(yǎng)過(guò)程中，腸外致病性大腸桿菌(Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli，ExPEC)是一種重要的細(xì)菌病原，ExPEC感染狐后可引起腦膜炎、尿道炎、母狐流產(chǎn)等，并常侵襲仔狐引發(fā)敗血癥導(dǎo)致死亡。據(jù)報(bào)道，從秦皇島地區(qū)病死狐體內(nèi)分離的ExPEC中，O1血清型占比較高，是該地區(qū)主要流行血清型之一[1]。近年來(lái)，我國(guó)山東、東北三省、河北等地區(qū)均有研究[2-4]證明，從臨床分離的狐源大腸桿菌具有嚴(yán)重的多重耐藥，給臨床治療狐源大腸桿菌病帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在解決致病菌株對(duì)抗生素類(lèi)耐藥問(wèn)題中，中草藥作為抗生素藥物的替代藥已成為研究的熱點(diǎn)。部分中草藥具有抗菌、消炎、滋補(bǔ)等功效，并有研究證實(shí)多種中草藥對(duì)多種家禽、家畜以及水產(chǎn)動(dòng)物致病菌具有良好的抑菌效果[5-7]。

本研究以臨床分離的狐源O1型腸外致病性大腸桿菌為試驗(yàn)菌株，檢驗(yàn)15味中藥水煎劑對(duì)試驗(yàn)菌株的體外抑菌效果，以期篩選出對(duì)秦皇島地方流行性狐源大腸桿菌具有良好抑菌效果的中草藥，為臨床應(yīng)用中草藥治療該地區(qū)狐源大腸桿菌病提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)菌株

狐源O1型腸外致病性大腸桿菌QHEO1，分離自秦皇島地區(qū)某毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)的病死銀狐(Vulpesvulpesfulva)心血，該銀狐6月齡，臨床剖檢以嚴(yán)重?cái)⊙Y為主。分離后加甘油置于實(shí)驗(yàn)室超低溫冰箱凍存。

1.2 主要試劑

15味中藥(五味子、黃芩、石榴皮、白頭翁、秦皮、五倍子、女貞子、烏梅、黃連、板藍(lán)根、訶子、連翹、金銀花、黃柏、柴胡)，購(gòu)自秦皇島唐人醫(yī)藥藥店；伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基為北京陸橋科技股份有限公司產(chǎn)品；體積分?jǐn)?shù)2%的氯化三苯四氮唑(TTC)為北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；96孔細(xì)菌培養(yǎng)板為美國(guó)Corning公司產(chǎn)品。

1.3 中草藥水煎劑制備

稱(chēng)取100 g中草藥，置于燒杯中，加入5—10倍中藥體積的蒸餾水浸泡1 h，置于加熱器上大火煮沸，后改為文火繼續(xù)煎煮0.5 h，倒出水煎藥液，再次加蒸餾水煎煮1次，時(shí)間為0.5 h。將2次的中藥水煎劑用12層紗布過(guò)濾，離心，文火濃縮至生藥濃度(1 g/mL)，分裝藥液后121℃高壓滅菌15 min。

1.4 試驗(yàn)菌液制備

將QHEO1菌株接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基，置于37℃隔水式恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h，挑取有金屬光澤的單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基，置于37℃、轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫?fù)u床培養(yǎng)12 h，以1∶100的比例再次接種于LB液體培養(yǎng)基，置于上述恒溫?fù)u床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，即用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀檢測(cè)菌液OD600約為0.6。用無(wú)菌PBS洗滌菌液后調(diào)整菌液濃度約為1×106cfu/mL后立刻進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.5 測(cè)定中草藥體外抑菌直徑

采用瓊脂打孔法測(cè)定15味中草藥對(duì)QHEO1菌株的體外抑菌直徑。在超凈工作臺(tái)中向LB固體培養(yǎng)基中加入100 μL制備的QHEO1菌液，晾干液體后用已滅菌的打孔器在培養(yǎng)基上打出直徑為6 mm的圓孔，每個(gè)平板打4個(gè)孔，孔間距均勻且適中，用酒精燈封孔底。向孔中加入100 μL中草藥水煎劑，對(duì)照孔加入同劑量的無(wú)菌PBS，置于上述恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h后測(cè)定抑菌圈直徑，試驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值為最終結(jié)果。抑菌圈直徑(D)判定標(biāo)準(zhǔn)：D≥20 mm，為極敏；15 mm≤D<20 mm，為高敏；10 mm≤D<15 mm，為中敏；0 mm≤D<10 mm，為低敏；D=0 mm，為無(wú)抑菌效果。

1.6 中草藥的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測(cè)定

采用改良微量二倍稀釋平板法測(cè)定中草藥水煎劑對(duì)QHEO1菌株的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)和最小殺菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)測(cè)定。將96孔細(xì)菌培養(yǎng)板在超凈臺(tái)酒精燈附近無(wú)菌區(qū)打開(kāi)，用移液器向第2—第11孔加入100 μL高壓后的蒸餾水，繼續(xù)在第2孔加入100 μL制備的中草藥水煎劑，混勻，取100 μL依次倍比稀釋至第9孔后棄液，向第2—第11孔內(nèi)加入100 μL 2×LB液體培養(yǎng)基，向第2—第10孔加入10 μL菌液。第10孔為陽(yáng)性對(duì)照孔(未加入中草藥水煎劑)，第11孔為陰性對(duì)照孔(未加入菌液)。將細(xì)菌培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。

培養(yǎng)后向每孔加入5 μL體積分?jǐn)?shù)2%的TTC，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后觀(guān)察，以不顯紅色的孔內(nèi)中草藥水煎劑最高稀釋倍數(shù)的濃度為MIC。

取50 μL細(xì)菌培養(yǎng)板中的培養(yǎng)物涂布于LB固體培養(yǎng)基，置于上述培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，以無(wú)菌落生長(zhǎng)的培養(yǎng)液中草藥水煎劑最小濃度為MBC。

試驗(yàn)成立標(biāo)準(zhǔn)為，陰性對(duì)照孔不變紅且無(wú)菌落長(zhǎng)出，陽(yáng)性孔變紅且有菌落長(zhǎng)出。重復(fù)試驗(yàn)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 中草藥體外抑菌直徑

試驗(yàn)結(jié)果(表1)顯示：15味中草藥中，石榴皮水煎劑對(duì)QHEO1菌株的抑菌圈直徑最大，表現(xiàn)為極敏；五味子水煎劑的抑菌圈直徑排名第2，表現(xiàn)為高敏；烏梅、訶子、五倍子、女貞子也出現(xiàn)抑菌圈，判定結(jié)果均為中敏。黃芩、白頭翁、秦皮等9味中草藥水煎劑加入的孔無(wú)抑菌圈，判定為無(wú)抑菌效果。

表1 15味中草藥對(duì)狐源QHEO1的體外抑菌效果Tab.1 Results of in vitro antibacterial efficacy of 15 Chinese herbal medicines

2.2 中草藥的MIC和MBC

MIC和MBC測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可見(jiàn)，石榴皮、訶子、五味子水煎劑MIC數(shù)值最低，為15.63 mg/mL，烏梅、五倍子、女貞子水煎劑MIC為31.25—62.5 mg/mL，黃芩、白頭翁、秦皮等9味中草藥對(duì)試驗(yàn)菌株未表現(xiàn)出抑菌效果。石榴皮和五味子的MBC數(shù)值最低，為15.63 mg/mL，烏梅、訶子、五倍子、女貞子水煎劑MBC為31.25—125 mg/mL，黃芩、白頭翁、秦皮等9味中草藥對(duì)試驗(yàn)菌株未表現(xiàn)出抑菌效果。

3 結(jié)論與討論

為研究石榴皮、五味子、烏梅等15味中草藥水煎劑作為臨床治療腸外致病性大腸桿菌病可行性，對(duì)15種中草藥的體外抑菌效果進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，秦皇島狐源地方流行性大腸桿菌株QHEO1對(duì)15味中草藥表現(xiàn)出不同程度的敏感性，中草藥水煎劑抑菌效果從高到低依次為石榴皮、五味子、烏梅、五倍子、訶子、女貞子。石榴皮具有澀腸止瀉、驅(qū)蟲(chóng)等功效，常用于久瀉、久痢、便血等的治療，據(jù)報(bào)道其對(duì)雞、豬、水貂(Neovisonvison)等多種畜禽源致病菌(大腸桿菌Escherichiacoli、沙門(mén)菌Salmonellaspp.、綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa等)和水產(chǎn)動(dòng)物致病菌(變形桿菌Proteus、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、副溶血弧菌Vibrioparahaemolyticus)等均具有良好的抑菌效果[8-12]。因此，可將石榴皮作為狐源大腸桿菌治療藥物進(jìn)一步研究：如石榴皮對(duì)不同血清型狐源致病性大腸桿菌的抑菌效果，驗(yàn)證石榴皮與其他中草藥(如本研究中同樣具有較好抑菌效果的五倍子、烏梅等)配伍組方制劑的抑菌效果，進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)以及臨床應(yīng)用檢驗(yàn)石榴皮對(duì)狐源大腸桿菌病的治療效果等。

本研究中，黃芩、白頭翁、秦皮等中草藥水煎劑對(duì)試驗(yàn)菌株未表現(xiàn)出抑菌效果，可能與提取方法和試驗(yàn)菌株有關(guān)，需更換提取方法，如改用其他親水性或親脂性溶劑提取，或采用浸漬法、水蒸氣蒸餾法等方法提取等；更換同一血清型或不同血清型狐源大腸桿菌作為試驗(yàn)菌株驗(yàn)證中草藥的抑菌效果。

本研究采用水煎煮法提取了15味中草藥，驗(yàn)證了其對(duì)秦皇島狐源O1型腸外致病性大腸桿菌的抑菌效果，篩選出具有抑菌效果的石榴皮、五味子、烏梅、五倍子、訶子、女貞子6味中藥，可為中草藥水煎劑治療狐源大腸桿菌病的提供參考。