應(yīng)用Illumina MiSeq測序技術(shù)對(duì)腹瀉北平頂猴腸道菌群的分析

金 潔 張飛燕 張慶宇 王 蕓 呂龍寶*

(1.中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，昆明，650223；2.國家非人靈長類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫，昆明，650223)

平頂猴(Macaca)是舊大陸猴中唯一易感艾滋病毒1型(HIV-1)的靈長類(Primates)動(dòng)物[1]，其生理結(jié)構(gòu)、機(jī)體代謝等方面與人類極為相似，是研究艾滋病病毒、新藥臨床前試驗(yàn)和安全評(píng)價(jià)的理想動(dòng)物模型[2-3]。此外，由于平頂猴具有復(fù)雜而精細(xì)的神經(jīng)活動(dòng)和行為，也常常用于研究腦結(jié)構(gòu)和功能。根據(jù)所在地域，平頂猴被劃分為3個(gè)種：南平頂猴(M.nemestrina)、北平頂猴(M.leonina)和明打威猴(M.pagensis)，其中分布在中國的平頂猴被稱為北平頂猴[4]。2012年，中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所在國內(nèi)率先建成北平頂猴飼養(yǎng)繁殖基地，通過長期的臨床病例統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在北平頂猴消化道疾病中腹瀉的發(fā)病率較高，約占10%，嚴(yán)重者可出現(xiàn)脫水，甚至休克。據(jù)報(bào)道，在臨床上能引起腹瀉的病因非常多且復(fù)雜，如：腸源性疾病[5]、內(nèi)分泌疾病[6]、腫瘤[7]和抗生素[8]等，其共同的臨床癥狀均包括腸道菌群失調(diào)。在健康動(dòng)物體內(nèi)，腸道菌群處于動(dòng)態(tài)平衡中，與宿主協(xié)同進(jìn)化互利共生，對(duì)維持宿主健康具有重要意義。當(dāng)這種平衡被打破時(shí)，如：益生菌豐度減少、有害菌豐度大量繁殖，會(huì)造成各種炎癥、腸胃疾病等，常出現(xiàn)腹瀉癥狀。菌群失調(diào)可能是引起疾病的原因，或是疾病導(dǎo)致的結(jié)果。目前，對(duì)北平頂猴腸道菌群的研究尚未有報(bào)道。為了探究北平頂猴的腸道菌群結(jié)構(gòu)及其腹瀉過程中腸道菌群的失調(diào)規(guī)律，本研究對(duì)健康和腹瀉北平頂猴的腸道菌群進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)合腸道微生態(tài)平衡的機(jī)理，揭示可能導(dǎo)致腹瀉的菌群及其變化規(guī)律，為平頂猴腹瀉治療用藥和益生菌制劑的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 糞便樣品的采集

在中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所選取健康和腹瀉雄性成年(5—10歲)北平頂猴各6只，分別采集其新鮮糞便于采糞管中，并將裝有糞便的采糞管放入液氮罐中帶回實(shí)驗(yàn)室。在超凈臺(tái)中取糞便內(nèi)部分裝，對(duì)健康樣本編號(hào)H1—H6、腹瀉樣本編號(hào)D1—D6，所有樣本均置于冰箱中-80℃凍存，準(zhǔn)備送樣測序。本試驗(yàn)中的12只北平頂猴均單籠飼養(yǎng)于普通環(huán)境，每只北平頂猴的糞便樣品在排泄后10 min內(nèi)完成收集。

1.2 細(xì)菌總DNA提取

使用MOBIO公司PowerFecalTMDNA試劑盒抽提12個(gè)糞便樣本中細(xì)菌的總DNA，分別用質(zhì)量濃度1%的瓊脂糖凝膠電泳和Qubit 4儀器檢測DNA質(zhì)量。具體提取步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3 PCR擴(kuò)增及高通量測序

PCR擴(kuò)增及高通量測序工作由北京諾禾致源生物信息科技有限公司完成。主要步驟如下：DNA質(zhì)量合格后，用無菌水將其稀釋至1 ng/μL，利用稀釋后的總DNA為模板。使用特異引物515F(5′-GTGCCAGCMCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)選取細(xì)菌16S rRNA V3—V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增PCR產(chǎn)物合格后，根據(jù)產(chǎn)物濃度等量混樣，并使用質(zhì)量濃度2%的瓊脂糖凝膠電泳(1×TAE)純化PCR產(chǎn)物，切膠回收目標(biāo)條帶。使用高通量建庫試劑盒進(jìn)行建庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)Qubit 4定量檢測合格后，采用高通量測序平臺(tái)Illumina HiSeq進(jìn)行測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

根據(jù)Barcode拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列得到原始數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)經(jīng)FLASH拼接[9]、QIIME過濾[10]、Algorithm軟件去除嵌合體后[11]，通過Overlap關(guān)系將Reads拼接成Tags，從而得到有效數(shù)據(jù)。在97%的一致性下將序列聚類成為OTUs(operational taxonomic units)。使用QIIME軟件計(jì)算每個(gè)樣品的Alpha多樣性指數(shù)，包括Chao1指數(shù)、ACE指數(shù)以及Shannon指數(shù)；用R軟件繪制稀釋曲線、Rank abundance曲線；計(jì)算Unifrac距離，并利用OTUs的豐度信息得到weighted UniFrac距離[12]；同時(shí)通過PICRUSt菌群功能預(yù)測的方法評(píng)估北平頂猴腸道菌群的功能。各組數(shù)據(jù)組間差異的顯著性均采用IBM SPSS Statistics 24軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果與OTU聚類

12個(gè)樣本經(jīng)測序后得到931 869條原始數(shù)據(jù)，通過拼接、質(zhì)控和嵌合體過濾，共得到880 904條可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。在97%相似度下將所有樣品的有效序列聚類為用于物種分類的OTU，如表1所示，健康組OTUs數(shù)大于腹瀉組，且兩組間差異顯著(P=0.023)。

2.2 細(xì)菌群落豐富度和多樣性

從圖1A可以看出，稀釋曲線在序列數(shù)為46 846條后趨向平坦，說明取樣的數(shù)量合理，更多的取樣量只會(huì)產(chǎn)生少量新OTUs。Rank abundance曲線反映樣品中物種的豐富度和均勻度，如圖1B所示，健康組樣本的豐富度均高于腹瀉組樣本?；谝陨蟽牲c(diǎn)，此次測序數(shù)據(jù)量合理，測序深度已基本覆蓋樣品中所有細(xì)菌。

Alpha多樣性用于分析樣品內(nèi)的微生物群落多樣性。其中，Shannon指數(shù)越大表明菌群多樣性越強(qiáng)，Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)越大表明樣品中的物種越豐富。根據(jù)表1所示，健康組的細(xì)菌菌群多樣性顯著高于腹瀉組(香農(nóng)指數(shù)，P=0.015)，健康組的細(xì)菌菌群豐度顯著高于腹瀉組(Chao1指數(shù)，P=0.014；ACE指數(shù)，P=0.032)。此外，覆蓋率(coverage)作為反映測序深度的指標(biāo)，其值越接近于1，表明測序深度越能覆蓋到樣品中所有的物種。本試驗(yàn)中各組樣本覆蓋指數(shù)均大于0.99，說明樣本中序列沒有被測出的概率極低。

2.3 Beta多樣性

Beta多樣性組間差異分析中，weighted UniFrac距離常用來衡量樣品間的物種多樣性的差異，距離與樣品間的物種多樣性差異呈正比。與健康組比較，腹瀉組的weighted UniFrac距離顯著降低(P=0.036)，表明腹瀉組與健康組在物種多樣性方面存在顯著性差異(圖2A)。主成分分析(PCA)能將樣本間的差異反映在二維坐標(biāo)圖上。樣本的群落組成越相似，則它們?cè)赑CA圖中的距離越接近。圖2B顯示，健康組和腹瀉組分布在不同區(qū)域，表明健康平頂猴和腹瀉平頂猴的腸道菌群組成存在一定差異。

2.4 門分類水平上的細(xì)菌組成

從門分類水平，按相對(duì)豐度前10作圖(圖3)。健康組的厚壁菌門(Firmicutes，54.89%)顯著高于腹瀉組(45.63%)，而擬桿菌門(Bacteroidetes，42.87%)明顯低于腹瀉組(49.11%)。此外，平均相對(duì)豐度高于1%的門，健康組有螺旋體門(Spirochaetes，1.67%)，腹瀉組有變形菌門(Proteobacteria，1.33%)和未鑒定細(xì)菌(unidentified Bacteria，1.83%)。

2.5 屬分類水平上的細(xì)菌組成

在屬水平進(jìn)行分析，按相對(duì)豐度平均值排名前10的菌屬作圖(圖4)。健康組乳桿菌屬(Lactobacillus，12.35%)、普氏菌屬(Prevotella，5.23%)和未鑒定瘤胃球菌屬(unidentified Ruminococcaceae，4.26%)的平均相對(duì)豐度明顯高于腹瀉組(3.57%，2.47%，3.40%)，而鏈球菌屬(Streptococcus，5.72%)、糞桿菌屬(Faecalibacterium，1.73%)和彎曲桿菌屬(Campylobacter，0.74%)的相對(duì)豐度明顯低于腹瀉組(10.25%，4.82%，2.09%)。

2.6 PICRUSt基因預(yù)測

PICRUSt根據(jù)測序數(shù)據(jù)預(yù)測樣品中的細(xì)菌功能類別相對(duì)豐度，獲得的預(yù)測結(jié)果通過KEGG基因家族進(jìn)行分類，結(jié)果顯示健康組與腹瀉組優(yōu)勢(shì)基因分區(qū)明顯(圖5)。共獲得六大類功能(不包含未預(yù)測出的和未分類的)：細(xì)胞加工、環(huán)境信息處理、有機(jī)體系統(tǒng)、人類疾病、代謝作用、基因信息處理?；蚬δ茴A(yù)測熱圖(圖6)表明，健康與腹瀉組的基因功能存在一定差異，其中健康組的優(yōu)勢(shì)基因主要集中在與細(xì)胞加工、環(huán)境信息處理等功能方面，而腹瀉組則主要集中在與有機(jī)體系統(tǒng)、人類疾病和代謝作用相關(guān)的方面。

3 討論

本試驗(yàn)分別采集了6只健康和6只腹瀉北平頂猴糞樣，利用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對(duì)2組北平頂猴的腸道菌群進(jìn)行分析比較，獲得稀釋曲線趨于平坦，測序覆蓋率已達(dá)99.99%，說明檢測出的微生物群落已基本覆蓋腸道內(nèi)所有細(xì)菌。

健康組細(xì)菌的OTUs和Alpha多樣性均顯著高于腹瀉組；Beta多樣性分析顯示，健康組和腹瀉組的腸道菌群在物種多樣性方面存在顯著差異。揭示了北平頂猴發(fā)生腹瀉可能與腸道內(nèi)細(xì)菌總數(shù)的變化和菌群結(jié)構(gòu)的多樣性有關(guān)。

在門水平上，北平頂猴的優(yōu)勢(shì)菌群為厚壁菌門和擬桿菌門，與非人靈長類(Primates)動(dòng)物腸道的優(yōu)勢(shì)菌群[13]相同，二者比例之和為70.50%—98.30%[14]。厚壁菌門可促進(jìn)宿主吸收或儲(chǔ)存能量，擬桿菌門可通過降解碳水化合物、蛋白質(zhì)等，促進(jìn)宿主吸收營養(yǎng)，平衡腸道微生態(tài)[15]。當(dāng)腸內(nèi)菌群失調(diào)，厚壁菌門相對(duì)豐度顯著高于擬桿菌門時(shí)會(huì)導(dǎo)致食物中的熱量更為有效地被吸收，從而引起肥胖[16-18]。北平頂猴腹瀉組腸道中厚壁菌門與擬桿菌門的比值低于健康組，可能是腹瀉猴機(jī)體吸收能量較低所致。螺旋體門不僅能有效降解纖維素，還能利用碳水化合物形成揮發(fā)性脂肪酸，為動(dòng)物機(jī)體提供能量[19]，健康組腸道內(nèi)螺旋體門平均相對(duì)豐度高于腹瀉組，進(jìn)一步解釋了健康動(dòng)物精神狀況較腹瀉動(dòng)物好的原因。變形菌門包括多種病原菌，例如：大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)等[20-21]，當(dāng)腸內(nèi)微生態(tài)失調(diào)，變形菌門相對(duì)豐度增加時(shí)常導(dǎo)致腹瀉。先前有報(bào)道，在健康人類的腸道內(nèi)變形菌門豐度較低，但某些致病因素會(huì)誘發(fā)其大量增殖，產(chǎn)生促炎因子，引起腸道炎癥和腹瀉[13]，因此本試驗(yàn)中腹瀉組腸道內(nèi)高豐度的變形菌門可能是導(dǎo)致北平頂猴發(fā)生腹瀉的因素之一。另外，在平均相對(duì)豐度低于1%的門中，放線菌門的多數(shù)物種有益于人體或者對(duì)人體無害，其中雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)通過生產(chǎn)醋酸鹽和乳酸鹽等調(diào)節(jié)腸道菌群[22]。腹瀉組放線菌門的平均豐度低于健康組，可能是菌群失調(diào)所致。

在屬水平上，乳桿菌屬可通過產(chǎn)酸改變腸道微生態(tài)環(huán)境，抑制病原菌與腸黏膜上皮細(xì)胞黏附，阻礙其在腸道內(nèi)定植、繁殖，減少疾病的發(fā)生[23-24]；普氏菌屬善于合成維生素B1，可作為益生菌替代菌分解食物中的糖類[14]，普氏菌屬與擬桿菌屬的比值越高，可能越益于宿主的代謝調(diào)節(jié)[25]。本試驗(yàn)中腹瀉組乳桿菌屬和普氏菌屬的平均相對(duì)豐度明顯低于健康組，導(dǎo)致腸內(nèi)益生菌減少、菌群失調(diào)，可能是誘導(dǎo)機(jī)體發(fā)生腹瀉的病因之一。彎曲桿菌屬是導(dǎo)致人類細(xì)菌性腹瀉的主要原因，人感染該菌后主要表現(xiàn)為急性腹瀉、發(fā)熱、腹痛和伴有血便等癥狀[26]。本試驗(yàn)中腹瀉組彎曲桿菌屬的相對(duì)豐度較健康組高也是引發(fā)腹瀉的因素之一。另外，某些鏈球菌屬可導(dǎo)致炎癥[27]，但本試驗(yàn)中鏈球菌屬與腹瀉發(fā)生的關(guān)系還有待進(jìn)一步探究。

腸道微生物與機(jī)體的免疫功能、消化吸收、能量代謝和生理功能等有關(guān)[28]。人類腸道微生態(tài)穩(wěn)態(tài)被破壞后可導(dǎo)致過敏[29]、肥胖和糖尿病[30]等。由此可見，腸道微生物平衡對(duì)于維持機(jī)體的正常生理功能具有重要作用。腹瀉發(fā)生時(shí)，伴隨機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)大量流失、免疫力下降，易增加疾病發(fā)生的概率，機(jī)體需要通過調(diào)節(jié)自身生理功改善這一現(xiàn)象，基因預(yù)測也驗(yàn)證了這一結(jié)果：腹瀉組功能基因主要與有機(jī)體、疾病和代謝相關(guān)。

4 小結(jié)

腸道菌群的平衡和失調(diào)是可逆的，本研究從微生態(tài)學(xué)角度對(duì)北平頂猴腸道菌群失衡與腹瀉之間的關(guān)系進(jìn)行了分析，以期為應(yīng)用干預(yù)腸道微生態(tài)治療北平頂猴腹瀉提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。