多金屬氧酸鹽抑制酪氨酸酶活性研究進(jìn)展

王安杏 方向紅 張 慶

（安徽職業(yè)技術(shù)學(xué)院 環(huán)境與化工學(xué)院，安徽 合肥 230011）

我國(guó)果蔬產(chǎn)量位居世界第一，但因保鮮不當(dāng)導(dǎo)致的果蔬損耗率為20%～30%，每年因此造成的損耗超過(guò)4 000億元[1]。酶促褐變是果蔬損耗的主要原因。酶促褐變不僅會(huì)影響果蔬外觀和風(fēng)味，還會(huì)降低果蔬營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。酶促褐變指果蔬中酚類(lèi)化合物在酚酶催化下氧化成鄰醌類(lèi)化合物，醌類(lèi)物質(zhì)經(jīng)過(guò)一系列氧化縮合聚合形成褐色產(chǎn)物，從而導(dǎo)致褐變發(fā)生[2]。因此，控制果蔬相關(guān)酶活性是防止和延緩果蔬褐變的重要手段，也是延長(zhǎng)果蔬貨架期、保持果蔬品質(zhì)的重要手段。

酪氨酸酶，又稱(chēng)多酚氧化酶（PPO），是一種含銅多功能氧化酶，主要存在于動(dòng)植物和微生物中，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。在疾病方面，酪氨酸酶活性的異常表達(dá)會(huì)引起色素沉著性疾病[3]。在食品領(lǐng)域，酪氨酸酶是引起果蔬發(fā)生酶促褐變的主要酶[4]。酪氨酸酶具有單酚酶活性和雙酚酶活性，可先將L-酪氨酸羥基化為L(zhǎng)-3，4-二羥基苯丙氨酸（L-DOPA），再氧化L-DOPA為多巴醌，醌是高活性物質(zhì)，能自發(fā)聚合形成黑色素[5]。酪氨酸酶抑制劑是通過(guò)降低酪氨酸酶活性而抑制黑色素合成，目前主要有天然提取物[6-7]、有機(jī)合成物[8]和無(wú)機(jī)化合物[9]。目前商業(yè)化的酪氨酸酶抑制劑是曲酸[10]和熊果苷[11]，但熊果苷對(duì)細(xì)胞有潛在毒性，而曲酸在治療濃度下會(huì)引起皮膚過(guò)敏[12]。因而開(kāi)發(fā)新型、安全、高效的酪氨酸酶抑制劑已成為食品保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

多金屬氧酸鹽（POM）是一類(lèi)無(wú)機(jī)金屬氧簇化合物，由于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的性能，不僅廣泛用于工業(yè)催化[13]，而且用于生物醫(yī)學(xué)[14-15]，具有抑菌[16-17]、抗病毒[18]、抗癌[19]、抗糖尿病[20]等特性。此外POM還具有很好的抑酶作用[3]，尤其是對(duì)酪氨酸酶的抑制[21]，有望使POM在果蔬保鮮方面應(yīng)用廣泛。

1 多金屬氧酸鹽（POM）對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

從抑制效果、抑制機(jī)理、抑制類(lèi)型三方面來(lái)探討POM對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。

1.1 抑制效果

POM對(duì)酪氨酸酶的抑制效果主要通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)法[22-23]研究。酶動(dòng)力學(xué)法是基于酪氨酸酶催化底物單酚（L-酪氨酸）或雙酚物質(zhì)（L-DOPA）生成的產(chǎn)物在475 nm波長(zhǎng)處有最大吸收峰，通過(guò)紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)量吸光度，從而測(cè)定酪氨酸酶活力。酶動(dòng)力學(xué)方法主要是通過(guò)IC50和抑制常數(shù)等參數(shù)綜合比較不同POM對(duì)酪氨酸酶抑制能力大小。

抑制效果實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)固定酶量和底物濃度，測(cè)定不同濃度抑制劑體系吸光度值隨時(shí)間變化的曲線，根據(jù)直線的斜率計(jì)算酶活力。以相對(duì)剩余酶活力對(duì)抑制劑濃度作圖，由圖可知酶活力下降50%對(duì)應(yīng)的抑制劑濃度即為半抑制濃度（IC50），一般IC50越小說(shuō)明抑制劑的抑酶效果好。POM對(duì)酪氨酸酶單酚酶活力的影響主要表現(xiàn)為對(duì)酶穩(wěn)態(tài)活力的抑制作用，并有遲滯時(shí)間，抑制劑對(duì)酪氨酸酶二酚酶活力的抑制沒(méi)有遲滯過(guò)程[24]。

表1 酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)

1.2 抑制類(lèi)型

抑制類(lèi)型實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)固定酶量，改變底物濃度，測(cè)定不同濃度抑制劑體系酪氨酸酶酶活力。可通過(guò)雙倒數(shù)作圖法，即以反應(yīng)速率倒數(shù)對(duì)底物濃度倒數(shù)作圖，測(cè)定抑制劑如何與酶結(jié)合，確定抑制類(lèi)型。以雙倒數(shù)圖中直線斜率和縱軸截距分別對(duì)抑制劑濃度進(jìn)行二次作圖，可分別求得KI和KIS，從而判斷抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制類(lèi)型[25]。一般抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制類(lèi)型有競(jìng)爭(zhēng)性抑制、非競(jìng)爭(zhēng)性抑制、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制和混合型抑制[26]。

1.3 抑制機(jī)理

抑制機(jī)理實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)固定底物濃度，改變酶量，測(cè)定不同濃度抑制劑體系酪氨酸酶酶活力，以酶活力對(duì)酪氨酸酶濃度作圖判斷抑制機(jī)理是可逆抑制還是不可逆抑制?？赡嬉种浦校种苿┡c酶以非共價(jià)鍵結(jié)合，通過(guò)抑制酶活力而導(dǎo)致催化效率降低，而不是通過(guò)減少有效酶量導(dǎo)致酶活力下降[27]。可逆抑制的特點(diǎn)是以酶剩余活力對(duì)酶濃度作圖，得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線，并且直線的斜率隨抑制劑濃度增大而降低。不可逆抑制中，抑制劑與酶以共價(jià)鍵結(jié)合使有效酶量減少而抑制酶活性[28]。不可逆抑制的特點(diǎn)是以酶剩余活力對(duì)酶濃度作圖，得到的一組在X軸上截距不同的平行直線，直線在橫坐標(biāo)上的截距隨抑制劑濃度增大而逐漸增大。

2 不同結(jié)構(gòu)的多金屬氧酸鹽（POM）抑制酪氨酸酶活性

POM主要有六種典型結(jié)構(gòu)[14]，其中在抑制酪氨酸酶活性方面研究較多的是Keggin型[29]和Dawson型[30-31]。

2.1 Keggin型POM抑制酪氨酸酶活性

2.1.1 不同類(lèi)型Keggin型POM抑酶活性

目前研究較多的抑制酪氨酸酶活性的Keggin型POM主要是磷鎢酸、磷鉬酸和硅鎢酸及其對(duì)應(yīng)過(guò)渡金屬取代物。其中純POM對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制效果為H3PMo12O40>H3PW12O40>H4SiW12O40，這可能是由于中心原子和配位原子不同使POM具有不同的氧化性和酸性。不同過(guò)渡金屬取代POM的抑酶活性具有差異，這可能與過(guò)渡金屬的離子半徑有關(guān)。

邢蕊[32]研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸基的過(guò)渡金屬取代的磷鉬酸鹽對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制效果均優(yōu)于對(duì)應(yīng)的過(guò)渡金屬取代的磷鉬酸鹽，可能是由于甘氨酸基與雜多陰離子形成無(wú)機(jī)-有機(jī)大分子復(fù)合物，其與酶相互作用產(chǎn)生較大的空間位阻而有效地抑制了酶活性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)（HGly）4SiW12O40的抑酶作用強(qiáng)于（HGly）3PW12O40，分析可能是因?yàn)榉春呻x子質(zhì)子化甘氨酸、雜多陰離子電荷數(shù)以及POM還原性差異引起的。

表3 Keggin型POM對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

2.1.2 影響Keggin型POM抑酶活性的因素

Joscha Breibeck等[33]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)完整的α-Keggin結(jié)構(gòu)的POM對(duì)蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制行為具有電荷依賴(lài)性，POM的抑酶能力與其雜多陰離子的凈電荷成反比，對(duì)凈電荷較低的K4SiW12O40和Na3PW12O40，POM的抑酶作用被它們顯著的水解作用部分抵消，而對(duì)于雜多陰離子電荷數(shù)為5和6的POM對(duì)酪氨酸酶二酚酶無(wú)抑制作用，甚至具有激活作用。在研究體系（pH=6.8）中，K4SiW12O40部分水解，但仍顯示出最強(qiáng)的抑制作用，而Na3PW12O40由于完全水解為中等活性的物質(zhì)，所以抑酶作用弱于K4SiW12O40。

影響POM抑酶活性的因素主要有中心原子、配原子、反荷離子、雜多陰離子電荷數(shù)、POM酸性、POM氧化還原性質(zhì)等。POM的結(jié)構(gòu)和組成對(duì)抑酶活性具有非常重要的影響。然而目前只針對(duì)Keggin型雜多陰離子電荷數(shù)這一種因素系統(tǒng)研究了其對(duì)POM抑酶活性的影響，未來(lái)還需要詳細(xì)研究其他因素的影響，便于總結(jié)規(guī)律，為設(shè)計(jì)酪氨酸酶抑制劑提供理論依據(jù)。

2.1.3 Keggin型POM抑酶機(jī)制

Chi等[34]合成了H3PMo12O40、Na7PMo11CoO40、Na7PMo11ZnO40，通過(guò)分子模擬研究了 POM對(duì)酪氨酸酶的作用機(jī)制，分子模擬研究與三種化合物的體外生物活性有很好的相關(guān)性。分子對(duì)接結(jié)果表明三種POM對(duì)酪氨酸酶具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，POM主要通過(guò)與酪氨酸酶中的Cu2+離子及能夠形成陽(yáng)離子-π和氫鍵的氨基酸殘基的更多相互作用而競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酪氨酸酶，從而形成可逆的非共價(jià)復(fù)合物。三種POM中H3PMo12O40的抑酶活性最高，可能是因?yàn)镠3PMo12O40能與酪氨酸酶中的His61 and His85兩種氨基酸殘基形成陽(yáng)離子-π相互作用，而另外兩種POM僅能與一種氨基酸殘基產(chǎn)生陽(yáng)離子-π相互作用，所以POM對(duì)酪氨酸酶的結(jié)合親和力和抑制能力會(huì)降低。

2.2 Dawson型POM抑制酪氨酸酶活性

由表4可知，目前研究較多的抑制酪氨酸酶活性的Dawson型POM主要是磷鉬酸及其過(guò)渡金屬取代物，并且對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制均為可逆競(jìng)爭(zhēng)性抑制。李莉莉等[35]研究了不同數(shù)目釩取代的Dawson型磷鉬酸對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性的抑制，發(fā)現(xiàn)隨著取代釩原子數(shù)的變化，POM的抑酶活性不同，推測(cè)可能是由于不同個(gè)數(shù)的釩原子取代影響了POM與酶的結(jié)合方式，從而造成抑酶活性的差異。由表4，根據(jù)IC50值可知取代型Dawson型磷鉬酸的抑酶活性為H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]>H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]>H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]>H8[P2Mo17Mn（OH2）O61]>H8[P2Mo17Co（OH2）O61]>H8[P2Mo17Ni（OH2）O61]>H6[P2Mo18O62]>H8[P2Mo17Cr（OH2）O61]，這可能與過(guò)渡金屬元素的離子半徑有關(guān)，也可能與元素的氧化還原電位有關(guān)。Hu等[36]合成了α/β-K6P2W18O62.10H2O，并研究了其對(duì)酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活性的抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)α/βK6P2W18O62.10H2O對(duì)單酚酶的抑制作用強(qiáng)于二酚酶，對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制為不可逆非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

表4 Dawson型POM對(duì)酪氨酸酶的抑制作用

3 多金屬氧酸鹽在果蔬保鮮中的應(yīng)用實(shí)例

目前POM用于果蔬保鮮的實(shí)例并不是很多，主要是用于鮮切蘋(píng)果片、藕片、紅毛丹果實(shí)的保鮮，并且都是通過(guò)浸泡的方式達(dá)到保鮮的效果。

Chen等[28]合成了α-Na8SiW11CoO40（SiW11Co），研究了其對(duì)蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用及對(duì)鮮切蘋(píng)果片的保鮮效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SiW11Co能夠有效抑制酪氨酸酶的活性，且存在劑量效應(yīng)，經(jīng)過(guò)SiW11Co處理的蘋(píng)果片保持了蘋(píng)果的營(yíng)養(yǎng)成分，顯著降低了蘋(píng)果的褐變程度，抑制多酚氧化酶的活性，提高過(guò)氧化物酶活性，促進(jìn)酚類(lèi)化合物和抗壞血酸含量的增加。李莉莉、遲國(guó)祥等[37-38]通過(guò)測(cè)定多項(xiàng)指標(biāo)評(píng)價(jià)H8[P2Mo17Mn（OH2）O61]（P2Mo17Mn）對(duì)鮮切蘋(píng)果的保鮮效果，結(jié)果表明P2Mo17Mn能夠有效減少鮮切蘋(píng)果水分的散失，顯著延緩蘋(píng)果質(zhì)量的損失和褐變進(jìn)程，減緩丙二醛含量的增加以及多酚氧化酶活性的增加，促進(jìn)過(guò)氧化物酶活性的增加，保持較好的色澤、香味、硬度和質(zhì)地，延長(zhǎng)了蘋(píng)果的貨架期。

Xing等[39]研究了Na6PMo11FeO40（PMo11Fe）對(duì)蘑菇酪氨酸酶的抑制作用及對(duì)藕片保鮮的影響，發(fā)現(xiàn)PMo11Fe對(duì)酪氨酸酶活性有顯著的抑制作用，且存在劑量效應(yīng)。通過(guò)測(cè)量相關(guān)生理生化指標(biāo)說(shuō)明PMo11Fe能夠顯著減緩藕片褐變速度，抑制多酚氧化酶活性，增強(qiáng)過(guò)氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，維持較高水平的谷胱甘肽、抗壞血酸和蔗糖。鄭阿萍[40]研究了POM對(duì)紅毛丹果實(shí)保鮮的簡(jiǎn)單應(yīng)用實(shí)驗(yàn)，使用POM浸泡新鮮紅毛丹，取出風(fēng)干、貯藏，觀察果實(shí)褐變程度，發(fā)現(xiàn)PW12的保鮮效果優(yōu)于其他三種POM。

4 總結(jié)與展望

POM在果蔬保鮮領(lǐng)域的應(yīng)用范圍應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)展，而不僅僅局限于蘋(píng)果、藕片等。此外應(yīng)該詳細(xì)研究不同因素對(duì)POM抑制酪氨酸酶活性的影響，確立POM對(duì)酪氨酸酶的結(jié)構(gòu)-抑制關(guān)系。POM和酪氨酸酶在分子水平上的反應(yīng)機(jī)制基本未知，需從分子水平上開(kāi)展POM對(duì)酪氨酸酶的作用機(jī)制研究，為設(shè)計(jì)新型、安全、高效的酪氨酸酶抑制劑提供理論依據(jù)。

目前已經(jīng)用于果蔬保鮮應(yīng)用的POM都是通過(guò)浸泡的方式達(dá)到保鮮效果，POM容易滲透到果蔬組織內(nèi)部，POM在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝是否會(huì)產(chǎn)生對(duì)生物體不利的衍生物和有毒物質(zhì)尚不清楚，應(yīng)探索新的保鮮方式，如將POM與其他材料復(fù)合合成新型食用膜。盡管POM的生物活性已經(jīng)研究了很多年，但相關(guān)毒理學(xué)研究報(bào)告相對(duì)較少，所以應(yīng)加強(qiáng)POM在生物體內(nèi)的活性研究，進(jìn)行毒理學(xué)分析，探索POM對(duì)生物體健康的影響，以期篩選出安全、高效的果蔬保鮮劑。