HPLC 一測多評法測定神術(shù)合劑中廣藿香酮等7 個活性成分的含量*

符必述，魏譚軍，王 麗，羅健華，楊芝芳，陳 飛，肖 成

達州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 藥學(xué)部，四川達州635000

神術(shù)合劑處方源于清代醫(yī)家程國彭《醫(yī)學(xué)心悟》卷三神術(shù)散，由蒼術(shù)（陳土炒）、陳皮、廣藿香、厚樸（姜汁炒）、甘草（炙）、砂仁等6 味中藥組成，主要用于對時行不正之氣，發(fā)熱頭痛、傷食停飲、胸滿腹痛、嘔吐瀉利等病癥的治療?，F(xiàn)代研究表明，神術(shù)制劑對濕疹、慢性胃炎以及常見婦科病等療效確切[1]；對嘔吐、呃逆、胃脘痛、小兒腹瀉等脾胃病療效顯著[2，3]，其聯(lián)合多潘立酮可有效改善功能性消化不良患者的臨床癥狀[4]；可提高脾虛濕阻型幽門螺旋桿菌臨床根除率，改善患者臨床癥狀及體征[5]。神術(shù)合劑為本院研發(fā)的醫(yī)院制劑。按照中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，選取君藥廣藿香的活性成分廣藿香酮，臣藥蒼術(shù)（陳土炒）的活性性成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素及佐藥陳皮的指標(biāo)性成分柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素為檢測指標(biāo)，以橙皮苷為內(nèi)參物，建立一測多評法檢測神術(shù)合劑上述7 個成分的含量，為建立神術(shù)合劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，全面評價神術(shù)合劑產(chǎn)品質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材 料

1.1 儀器

Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；LC-20AT 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Sartorius Quintix125D-1CN 型電子天平（德國賽多利斯公司）。

1.2 藥品與試劑

神術(shù)合劑（規(guī)格：每瓶裝100 mL；批號：200414、200508、200628）本院自制。對照品：白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（純度：99.9%，批號：111976-201501）、蒼術(shù)素（純度：99.5%，批號：111924-201806）、橙皮苷（純度：96.2%，批號：110721-201818）均購自中國食品藥品檢定研究院；柚皮蕓香苷（純度：99.7%，批號：18071023）、川陳皮素（純度：99.9%，批號：18030541）均購自上海同田生物技術(shù)公司；橘紅素（純度：98.7%，批號：PRF8063048）、廣藿香酮（純度：99.0%，批號：PRF8072523）均購自成都普瑞法科技公司。乙腈為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～11 min，36.0%A；11～20 min，36.0%A→41.0%A；20～36 min，41.0%A →58.0%A；36～44 min，58.0%A→72.0%A；44～50 min，72.0%A→36.0%A）；檢測波長分別為270nm（0～20 min 檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和蒼術(shù)素）[6]和310 nm（20～50 min 檢測柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素和廣藿香酮）[7,8]；柱溫：25℃；流速：0.8 mL·min-1；進樣量：10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

分別精密稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮對照品適量，用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.474、1.056、0.938、1.172、0.294、0.148、0.112 mg·mL-1的混合對照品貯備液。精密吸取該貯備液2.5 mL，用甲醇稀釋定容至50 mL，得白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ23.7 μg·mL-1、蒼術(shù)素52.8 μg·mL-1、柚皮蕓香苷46.9 μg·mL-1、橙皮苷58.6 μg·mL-1、川陳皮素14.7 μg·mL-1、橘紅素7.4 μg·mL-1、廣藿香酮5.6 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液及陰性樣品溶液的制備

精密量取神術(shù)合劑1.0mL，置25mL 量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，0.45μm 微孔濾膜過濾，即得。

按神術(shù)合劑處方分別制備缺蒼術(shù)、缺陳皮、缺廣藿香的陰性樣品，按上述方法制備陰性樣品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性要求

精取“2.2”項下混合對照品溶液和“2.3”項下各溶液適量，按“2.1”色譜條件進樣檢測，記錄色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示，在供試品溶液中7 個目標(biāo)成分在對照品色譜峰相同保留時間處有相應(yīng)的色譜峰，與相鄰色譜峰的分離度均＞1.5；理論塔板數(shù)按廣藿香酮等7 個活性成分的色譜峰計不得低于3500，陰性樣品對神術(shù)合劑中7 個目標(biāo)成分的測定無干擾。

圖1 混合對照品（A）、神術(shù)合劑供試品（B）、蒼術(shù)陰性樣品（C）、陳皮陰性樣品（D）、廣藿香陰性樣品（E）HPLC 色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項下混合對照品貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別用甲醇稀釋定容至20 mL，制備系列質(zhì)量濃度混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮的峰面積，以各成分質(zhì)量濃度為X（μg·mL-1），相應(yīng)的峰面積為Y進行線性回歸，結(jié)果見表1。

表1 7 個目標(biāo)化合物回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)

2.6 進樣精密度試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液10 μL，按“2.1”色譜條件重復(fù)進樣6 次，測得白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮峰面積的RSD（n=6）分別為0.93%、0.66%、0.80%、0.57%、0.99%、1.08%、1.14%。

2.7 重復(fù)性試驗

取批號200414 神術(shù)合劑樣品適量，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，按“2.1”色譜條件進樣檢測，計算白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮含量的RSD（n=6）分別為1.54%、0.89%、1.35%、0.77%、1.49%、1.76%、1.83%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

精密吸取神術(shù)合劑同一份供試品溶液適量，按“2.1”色譜條件分別于0、2、4、8、16、24 h 進樣檢測7個成分的峰面積，結(jié)果供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮峰面積的RSD（n=6）分別為1.08%、0.82%、1.05%、0.91%、1.15%、1.30%、1.21%。

2.9 加樣回收率試驗

精密量取已知7 個成分的神術(shù)合劑0.5mL，共9份，分別按已知含量的50%、100%、150%三個水平精密加入混合對照品溶液（白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ0.129mg·mL-1、蒼術(shù)素0.287 mg·mL-1、柚皮蕓香苷0.242 mg·mL-1、橙皮苷0.329 mg·mL-1、川陳皮素0.087 mg·mL-1、橘紅素0.039mg·mL-1、廣藿香酮0.028mg·mL-1）1.0、2.0、3.0mL各3 份，按“2.3”項下方法制備加樣供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，結(jié)果所測成分的平均加樣回收率（RSD，n=9）分別為98.45%（1.29%）、100.05%（0.68%）、98.58%（1.80%）、99.05%（1.54%）、97.60%（1.51%）、96.98%（0.88%）、97.31%（1.03%）。

2.10 相對校正因子（RCF）的測定

精密吸取“2.5”項下6 種質(zhì)量濃度的混合對照品溶液各10 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮的峰面積，以橙皮苷為內(nèi)參物，按照RCF 計算公式：RCFks=（式中Ak為內(nèi)參物橙皮苷峰面積，Ws為其他成分質(zhì)量濃度，As為其他成分的峰面積，Wk為內(nèi)參物橙皮苷質(zhì)量濃度）分別計算白

術(shù)內(nèi)酯Ⅱ等6 個成分的RCF，結(jié)果見表2。

表2 以橙皮苷為內(nèi)參物的6 種成分的RCF

2.11 RCF 耐用性考察

2.1 1.1 不同柱溫精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ等6 個成分的峰面積，考察不同柱溫（20℃、22℃、25℃、28℃、30℃）對RCF 的影響，結(jié)果以均值（范圍）計，即RCF 分別為0.823 9、1.136 2、1.343 7、0.657 1、0.704 8、1.671 2，RSD 分別為0.97%、1.52%、1.01%、1.87%、1.19%、1.65%。

2.1 1.2 不同儀器、色譜柱精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮的峰面積，考察Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀、LC-20AT 型高效液相色譜儀和液相色譜柱Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Ultimate XB-C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）對RCF 的影響，上述化合物RCF 值得RSD 分別為0.73%、1.87%、1.39%、1.58%、0.84%、1.15%。

2.1 1.3 不同流動相流速精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ等6 個成分的峰面積，考察不同流速（0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL·min-1）對各RCF 的影響，其RSD 分別為0.54%、1.40%、1.28%、1.89%、1.26%、0.98。

2.12 待測組分色譜峰的定位

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測，記錄白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮色譜峰的保留時間，考察“2.11.2”所述2 個色譜儀和3 個色譜柱對相對保留時間值的影響，上述化合物其RSD分別為1.31%、1.76%、0.74%、1.13%、0.92%、0.27%。

2.13 一測多評法（QAMS）與外標(biāo)法（ESM）測定結(jié)果比較

取神術(shù)合劑樣品3 批，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣檢測白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、蒼術(shù)素、柚皮蕓香苷、橙皮苷、川陳皮素、橘紅素、廣藿香酮的峰面積，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計算上述成分的含量，結(jié)果見表3。

表3 各成分含量測定結(jié)果（mg·mL-1，n=3）

3 討論

本實驗參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則，采用一測多評法測定神術(shù)合劑中的7 個成分，為神術(shù)合劑的質(zhì)量可控性提供有力的實驗數(shù)據(jù)。

本方法在流動相選擇中，首先對等度流動相甲醇-水系統(tǒng)[9,10]、乙腈-水系統(tǒng)[11]進行了考察，發(fā)現(xiàn)甲醇-水系統(tǒng)出現(xiàn)基線嚴(yán)重漂移，干擾檢測；乙腈-水系統(tǒng)相對穩(wěn)定，但陳皮所含成分橙皮苷含量較高，出現(xiàn)色譜峰變形，與川陳皮素色譜峰不能完全分離，同時檢測用時較長；考慮加入0.1%磷酸溶液[8]、0.1%冰醋酸溶液[11]和0.1%甲酸溶液[7]，經(jīng)過大量試驗，最終采用乙腈-0.1%磷酸溶液進行梯度洗脫，實現(xiàn)了神術(shù)合劑中7 個化合物的同時分離分析，色譜分離基線平穩(wěn)，各成分色譜峰峰形對稱，分離度良好。

本研究采用一測多評法對神術(shù)合劑中廣藿香酮等7 個成分含量進行測定，該方法操作便捷，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好，有助于進一步提高、完善神術(shù)合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，確保產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床治療效果的一致性。