沉積物氮模擬釋放過程中氨氧化菌群落變化

劉卓，楊代瓊，李姣，陸瑩，盧昶雨

(1.河北地質(zhì)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)實(shí)踐教學(xué)中心，河北 石家莊 050031；2.河北地質(zhì)大學(xué) 水資源與環(huán)境學(xué)院 河北省水資源可持續(xù)利用與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 河北省水資源可持續(xù)利用與產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化協(xié)同創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050031；3.西安市市政設(shè)施管理中心，陜西 西安 710016；4.復(fù)旦大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程系，上海 200433)

近年來，國內(nèi)湖泊面臨著水質(zhì)逐年惡化、富營養(yǎng)化日益嚴(yán)重等問題，除了磷之外，氮也是限制湖泊富營養(yǎng)化的主要因子[1]。當(dāng)湖泊水體氮負(fù)荷較重時(shí)，部分形態(tài)氮會(huì)通過沉淀或者由顆粒物吸附而蓄存于沉積物中，使沉積物成為湖泊水體污染物的重要蓄積庫[2-6]。

針對(duì)湖泊沉積物界面氮交換通量問題的研究方法有質(zhì)量衡算法、孔隙水?dāng)U散模型、表層沉積物模擬法、柱狀芯樣模擬法和水下原位模擬法[7]。各類方法對(duì)沉積物氮釋放通量的研究主要集中于營養(yǎng)鹽釋放通量流動(dòng)培養(yǎng)[8]、釋放通量的估算[9]、釋放通量影響因素等[10]。其大部分均是針對(duì)沉積物-水界面氮釋放通量的單獨(dú)研究，氮釋放通量對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)間的影響則相對(duì)較少。沉積物-水界面微生物群落中硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)與各形態(tài)氮釋放通量有著密切的關(guān)系，氨氧化細(xì)菌(AOB)是硝化細(xì)菌中最主要的細(xì)菌之一，其可將氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，使得亞硝酸鹽繼續(xù)轉(zhuǎn)化為硝酸鹽[11-13]。

滇池海埂地區(qū)位于滇池草海和外海交界處，成為了滇池的一處藍(lán)藻聚集帶，污染相對(duì)較為嚴(yán)重。截止到采樣時(shí)間，整個(gè)區(qū)域被兩層圍隔圍成面積為0.5 km2的封閉區(qū)域。本研究通過對(duì)海埂地區(qū)沉積物氮釋放的模擬，研究氮釋放過程中釋放通量對(duì)沉積物-水界面氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為研究及控制海埂地區(qū)水體富營養(yǎng)化提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

水樣、底泥、沉積物均取自滇池海??；去離子水。

3 L有機(jī)玻璃水樣采集器；PSC-1/40彼得森挖泥器；Mobio Powersoil Isolation Kit試劑盒(100次/盒)；Applied Biosystems PCR擴(kuò)增器；sds-page變性梯度凝膠電泳(DGGE)；S4 EXPLORER X-射線熒光分析儀。

1.2 樣品采集

對(duì)海埂區(qū)域內(nèi)4個(gè)具有代表性的點(diǎn)位(見圖1)進(jìn)行樣品采集，#1為技術(shù)集成示范區(qū)(湖泊內(nèi)源污染控制技術(shù)集成區(qū)域)，僅進(jìn)行了短時(shí)間的藍(lán)藻清除工作；#2為風(fēng)浪較大區(qū)域；#3情況較為復(fù)雜，水深達(dá)3.5 m，位于兩層圍隔的航道之間，最外層圍隔并未把整個(gè)研究區(qū)圍成封閉式區(qū)域，因此#3的水體與外海水體之間有水質(zhì)交換；#4為水位最深處，水深達(dá)4 m。

圖1 采樣點(diǎn)分布示意圖Fig.1 Position of sampling sites

采用3 L有機(jī)玻璃水樣采集器采集水樣，采水器內(nèi)置溫度計(jì)，可現(xiàn)場(chǎng)讀出水溫，水樣均在24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。底泥使用彼得森挖泥器進(jìn)行采集，每個(gè)點(diǎn)位進(jìn)行多次采泥，每次采集表層底泥4～6 L，放入干凈盆中混勻，裝入保溫箱中，24 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行模擬實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用有機(jī)玻璃柱進(jìn)行沉積物氮釋放通量的模擬實(shí)驗(yàn)。有機(jī)玻璃柱下端封閉，上端帶有密封蓋子，沉積物(高度5 cm)灌入有機(jī)玻璃柱以后，通過虹吸法(防止底泥擾動(dòng))將去離子水緩慢注入有機(jī)玻璃柱，高度20 cm。實(shí)驗(yàn)4個(gè)點(diǎn)位沉積物釋放模擬反應(yīng)器分別放入恒溫培養(yǎng)箱。實(shí)驗(yàn)開始后，每天采樣1次，每次采樣位置為水面下10 cm處，每次采完水樣，立即向玻璃柱中注入等量的去離子水；同時(shí)，采取模擬反應(yīng)器表層沉積物樣品2～5 g，用于沉積物DNA提取。實(shí)驗(yàn)持續(xù)41 d，每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3組平行。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 DNA提取 根據(jù)Mobio Powersoil Isolation Kit試劑盒的操作說明，對(duì)沉積物樣本進(jìn)行基因組DNA抽提。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 AOB的PCR擴(kuò)增采用引物為CTO189fAB-GC(CCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGG GGCACGGGGGGAGRAAAGCAGGGGATCG)、CTO189f C-GC(CGCCCGCCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCA CGGGGGGAGGAAAGTAGGGGATCG)和CTO654r(CTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC)[14-15]，40 μL的反應(yīng)體系組成如下：20 μL BioLinker 2×Taq Mix，引物上游各1 μL，引物下游1 μL，模板1 μL 和適量的雙蒸水補(bǔ)足40 μL。反應(yīng)條件：94 ℃，2 min；94 ℃，30 s； 56.4 ℃，30 s；72 ℃，30 s，30個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下延伸5 min。

1.4.3 變性梯度凝膠電泳 (1)將20 μL PCR產(chǎn)物加入到8%(w/v)的聚丙烯酞胺凝膠(37.5∶1)中，凝膠的變性范圍為40%～60%[本研究中凝膠的100%變性為含有7 mol尿素和40%(v/v)的去離子甲酰胺(deionized Formamide)聚丙烯酰胺凝膠]；(2)將Bio-Rad制膠裝置傾斜放置，通過Bio-Rad Model475 Gradient Delivery System灌膠系統(tǒng)以從頂部注入凝膠的填充方式進(jìn)行梯度灌膠；下層膠凝固1～1.5 h后，灌上層0%膠；凝膠灌制完畢后，插入梳子；放置1～1.5 h，待膠凝固后，移除梳子，將凝膠裝置放于Bio-Rad水浴系統(tǒng)中，使溫度保持60 ℃；(3)電泳條件為：溫度60 ℃，電壓80 V，緩沖液l × TAE，電泳時(shí)間16.5 h，電泳完畢后，取出凝膠裝置，置于磁鋼容器中，加入400 mL Biolinker DNA Red染色液進(jìn)行染色40 min；(4)置于Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照，進(jìn)行凝膠影響分析。

1.4.4 樣品指標(biāo)的測(cè)定 水樣中各形態(tài)氮濃度采用國標(biāo)法《水和廢水檢測(cè)分析方法(第四版)》[16]測(cè)定；沉積物中TN過硫酸鉀消解法測(cè)定；底泥的pH值通過質(zhì)量與體積比1∶2.5的泥和水(0.01 mol/L KCl溶液)混合后測(cè)定渾濁液中的pH值[17]；底泥中有機(jī)質(zhì)(OM)含量通過樣品在550 ℃下煅燒4 h，樣品質(zhì)量差進(jìn)行測(cè)定[18]；樣品的金屬氧化物成分通過X射線熒光分析儀來測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

1.5.1 底泥各形態(tài)氮釋放通量 采用公式(1)和(2)進(jìn)行計(jì)算[19]。

(1)

(2)

式中Mn——每次測(cè)定期內(nèi)的釋放量,mg；

V——泥樣上覆水的體積,L；

Cn——第n次采樣時(shí)水中營養(yǎng)鹽濃度,mg/L；

C0——泥樣上覆水的初始營養(yǎng)鹽濃度,mg/L；

Vn——每次采集水樣體積,L；

N——采樣次數(shù)。

1.5.2 香農(nóng)指數(shù)(Shannon) 用來估算樣品中微生物的多樣性指數(shù)之一，其公式為：

(3)

H為香農(nóng)指數(shù)，S為DGGE膠中條帶數(shù)量，Pi為第i條帶灰度占該樣品總灰度的比率。豐富度指數(shù)(S)即為某個(gè)樣本中所有條帶的總和。

1.5.3 均勻度指數(shù)(E) 用來描述群落中個(gè)體數(shù)量在物種中的分布均勻狀況，亦是群落多樣性指數(shù)之一，其公式為[20]：

E=H/Hmax=H/lnS

(4)

1.5.4 辛普森指數(shù)(D) 用來測(cè)定群落中物種多樣性指數(shù)之一，其公式為[21]：

(5)

式中Ni為物種個(gè)體數(shù)，N為總個(gè)體數(shù)。

同時(shí)采用Quantiy one對(duì)微生物群落DGGE圖譜進(jìn)行分析、Canoco4.5用于主成分分析(PCA)和冗余分析(RDA)，Mothur等軟件開展基于PCR-DGGE技術(shù)的氨氧化菌群落多樣性研究。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積物理化性質(zhì)及各形態(tài)氮含量分析

4種沉積物的理化性質(zhì)見表1。

表1 4種沉積物的理化特性(均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差)Table 1 Physicochemical properties(mean value± standard deviation) of four sediments

由表1可知，相比其他點(diǎn)位沉積物，#3沉積物中TN含量較高，其可能造成該點(diǎn)位較高的氮釋放通量。有研究指出[22-24]，較高的有機(jī)質(zhì)和金屬氧化物含量有利于沉積物對(duì)各形態(tài)氮的吸附，因此會(huì)導(dǎo)致上覆水中氮含量的減小，其中#1沉積物含有較高的金屬氧化物含量，該點(diǎn)位沉積物對(duì)上覆水中各形態(tài)氮有較強(qiáng)的吸附能力，可能會(huì)影響實(shí)驗(yàn)中沉積物氮的釋放。沉積物中pH會(huì)影響AOB群落結(jié)構(gòu)，AOB最適生長pH為7.5～8.0，因此，#2和#3沉積物中AOB群落多樣性會(huì)相對(duì)較高。

2.2 沉積物氮釋放通量

見圖2(a)，NH4-N釋放通量在實(shí)驗(yàn)第1 d達(dá)到最高值1.25 mg/(m2·d)，且#3的NH4-N釋放通量遠(yuǎn)大于其他三個(gè)點(diǎn)位底泥的釋放通量，這可能由于該點(diǎn)位沉積物TN含量最高所導(dǎo)致。此外，在第25 d，NH4-N的釋放通量幾乎接近0 mg/(m2·d)，這說明在25 d時(shí)，底泥已不再向上覆水釋放NH4-N，且上覆水中NH4-N的濃度也較低；由圖2(a)可知，在底泥NH4-N釋放過程中，NH4-N的釋放通量在0～7 d是快速減小階段，在8～25 d內(nèi)，其釋放通量是緩慢減小階段，直至趨于0；當(dāng)釋放通量接近于0時(shí)，這表明上覆水中的NH4-N濃度也處于一個(gè)相對(duì)低的狀態(tài)，這可能是由于在整個(gè)模擬底泥釋放的系統(tǒng)中，底泥表層的硝化菌，尤其是AOB在起作用。

由圖2(b)可知，#2的NO2-N釋放通量在第4 d達(dá)到了最高，0.03 mg/(m2d)，其他3個(gè)點(diǎn)位底泥均在第5 d時(shí)釋放通量達(dá)到最高，依次為#3[0.09 mg/(m2d)]>#4[0.04 mg/(m2d)]>#1[0.035 mg/(m2d)]，其中#3沉積物NO2-N的釋放通量最大，在第6～15 d內(nèi)，NO2-N的釋放通量又迅速下降，趨向平衡。NO2-N的釋放通量呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢(shì)，這主要是由于實(shí)驗(yàn)開始階段，沉積物向上覆水釋放大量的NH4-N，經(jīng)過一定時(shí)間，NH4-N被氧化成NO2-N，在反應(yīng)器內(nèi)，AOB是導(dǎo)致該現(xiàn)象的主要原因。

圖2 NH4-N和NO2-N釋放通量的變化曲線Fig.2 Changes of NH4-N and NO2-N fluxes

2.3 氮釋放過程中AOB多樣性指數(shù)變化

4個(gè)點(diǎn)位在不同時(shí)間點(diǎn)AOB群落結(jié)構(gòu)的多樣性指數(shù)見表2。

由表2可知，#1的Shannon Wiener指數(shù)呈現(xiàn)一個(gè)先增后減的趨勢(shì)，在第13 d時(shí)達(dá)到2.434，說明#1的AOB數(shù)量和種類達(dá)到一定程度“飽和”后開始下降。#2的Shannon Wiener指數(shù)在第4 d時(shí)達(dá)到最大值2.280，這可能是因?yàn)?2的底泥性質(zhì)導(dǎo)致AOB的繁殖速度較快所造成。#3的Shannon Wiener指數(shù)較小，在1.446～1.887之間，且前13 d內(nèi)，指數(shù)大小變化不大(約為1.5)，在第21 d時(shí)，指數(shù)大小迅速增大，說明AOB群落的多樣性上升。#4的Shannon Wiener指數(shù)所呈現(xiàn)的規(guī)律與#3相似，前13 d指數(shù)大小在2.005～2.170之間，變化不大，第21 d時(shí)指數(shù)大小增加至2.341，說明AOB群落的多樣性上升。Simpson指數(shù)亦是反映群落多樣性的一項(xiàng)指標(biāo)，見表2，Simpson指數(shù)與Shannon Wiener指數(shù)的變化趨勢(shì)基本一致。

表2 AOB多樣性指數(shù)表Table 2 Diversity values of AOB

豐富度指數(shù)是指樣品中所有條帶數(shù)總和，由表2可知，第13 d時(shí)，#1的豐富度指數(shù)最大，即條帶數(shù)最多，此時(shí)#1的樣品中AOB物種數(shù)量最多，這也從側(cè)面反映了#1在第13 d的AOB群落的多樣性最高，和Shannon Wiener指數(shù)變化所呈現(xiàn)的趨勢(shì)一樣。#2的豐富度指數(shù)在16～18之間，變化不大，AOB物種數(shù)量變化較小。#3在前13 d內(nèi)，各樣品條帶數(shù)相同，說明物種數(shù)量基本不變，在第21 d時(shí)，條帶數(shù)量迅速上升，說明#3樣品中AOB物種數(shù)量增加，群落多樣性也隨之發(fā)生變化。#4的豐富度指數(shù)則呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)，物種數(shù)量也穩(wěn)步增加。

2.4 氮釋放過程中AOB的DGGE圖譜分析

氨氧化菌DGGE電泳圖見圖3(a)，從第1 d起，到第9 d，AOB條帶總數(shù)、種類及灰度都發(fā)生了較大的變化，尤其是第9 d到第21 d過程中，條帶數(shù)遠(yuǎn)大于前5個(gè)時(shí)期，說明在第21 d時(shí)，4個(gè)點(diǎn)位泥-水界面AOB的群落較為豐富，且結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大的變化。同時(shí)部分條帶的灰度增大也說明了相關(guān)種群在泥-水界面占據(jù)了一定優(yōu)勢(shì)。在沉積物氮釋放的前9 d，NH4-N的釋放通量大幅度減小，除#3沉積物，其他3個(gè)點(diǎn)位沉積物NH4-N的釋放通量在第9 d 時(shí)均趨向于0，沉積物-水界面AOB活躍，因此1～13 d的AOB條帶總數(shù)變化較大。9～21 d期間，可能是由于硝化菌中的亞硝酸鹽氧化菌的活躍導(dǎo)致條帶數(shù)的增多。

見圖3(b)，相較第21 d時(shí)AOB群落結(jié)構(gòu)，#1、#2、 #3和#4均在第6 d時(shí)菌群結(jié)構(gòu)變化最大，與第21 d 的相似度分別降至58.9%，76.9%，69.5%，57.6%；#1、#2、#3和#4底泥在第1，4，6，9 d菌群結(jié)構(gòu)變化較為平緩，AOB種群結(jié)構(gòu)無明顯變化，在前9 d 的4個(gè)時(shí)間段與第21 d的相似度分別維持在58%～65%，76%～79%，69%～74%和57%～69%，這表明在9 d以內(nèi)，不同種類的AOB在適應(yīng)環(huán)境變化的此消彼長，9 d以后，AOB種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，這也是導(dǎo)致前9 d NH4-N的釋放通量快速減小，NO2-N的釋放通量先增加后減小，變化不穩(wěn)定的主要原因之一；此外，#1和#4，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，前9 d的AOB菌群結(jié)構(gòu)與第21 d相比變化較大，主要是由于這兩個(gè)點(diǎn)位沉積物pH值較低，迫使AOB群落不斷適應(yīng)環(huán)境而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化。

圖3 氨氧化菌DGGE凝膠電泳圖像(a)和經(jīng)過Quantity One處理過后的電泳圖(b)Fig.3 DGGE pattern of AOB(a) and DGGE pattern after the treatment by Quantity One(b)1～6樣品分別表示第1，4，6，9，13，21 d樣品

2.5 氮釋放過程中AOB群落PCA和RDA分析

圖4(a)為各點(diǎn)位AOB主成分分析，第一主成分可以解釋總變量的57.2%，第二主成分可以解釋總變量的20.4%，兩個(gè)主成分共同解釋隨時(shí)間AOB群落變化的77.6%。4個(gè)點(diǎn)位的AOB群落結(jié)構(gòu)在圖上分別成簇出現(xiàn)，同一點(diǎn)位各時(shí)間段樣品在主成分1和2上無明顯差異，各點(diǎn)位之間在主成分1和2上表現(xiàn)差異明顯。#3與其他3個(gè)點(diǎn)位在主成分1上有顯著差異，說明#3沉積物-水界面AOB對(duì)主成分1代表的群落分布結(jié)構(gòu)與其他3個(gè)點(diǎn)位不同。#2和#4沿PC2軸兩端分布，#2和#4兩個(gè)點(diǎn)位群落在主成分2上有顯著差異，說明#2泥-水界面AOB對(duì)主成分2代表的群落分布結(jié)構(gòu)與#4不同[25-26]。

將DGGE圖譜數(shù)字化的4個(gè)點(diǎn)位各時(shí)間段AOB群落信息與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中氨氮、亞硝氮、硝氮、pH和時(shí)間(Day)這5個(gè)外界環(huán)境因子進(jìn)行冗余分析，考察不同點(diǎn)位不同時(shí)間段AOB和NOB與環(huán)境因子變量之間的關(guān)系。分析結(jié)果見圖4(b)，用箭頭表示各個(gè)環(huán)境因子，不同形狀的圖形表示不同點(diǎn)位樣品的群落結(jié)構(gòu)信息，箭頭的長度表示AOB群落結(jié)構(gòu)與該環(huán)境因子相關(guān)系數(shù)的大小，連線越長，相關(guān)性越高；箭頭和排序軸所構(gòu)成的夾角大小表示箭頭代表的環(huán)境因子與排序軸相關(guān)性大小，夾角度數(shù)越小，相關(guān)性越高，箭頭所處的象限表示該環(huán)境因子與排序軸相關(guān)系數(shù)的正負(fù)。

圖4 4個(gè)點(diǎn)位沉積物實(shí)驗(yàn)期間AOB群落多樣性PCA(a)和RDA(b)分析Fig.4 PCA(a) and RDA(b) of AOB community diversity for four sediments

由圖4(b)可知，本研究中，RDA分析結(jié)果的雙序圖表明了各環(huán)境因子對(duì)各點(diǎn)位各時(shí)間段樣品的影響：#4的大部分時(shí)間點(diǎn)樣品(組Ⅰ)受到了NH4-N的顯著影響，#2的4～21 d的時(shí)間點(diǎn)和#3的13～21 d 時(shí)間點(diǎn)樣品(組Ⅱ)主要受到pH和NO3-N的影響，且受pH影響顯著，#3的1～9 d和#1各樣品(組Ⅲ)受到了NO2-N的影響，但影響不顯著。

第一軸能解釋AOB群落結(jié)構(gòu)異變的28.4%，反映AOB群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)為0.814；第二軸能解釋AOB群落結(jié)構(gòu)異變的9.3%，反映AOB群落結(jié)構(gòu)和環(huán)境因子的相關(guān)系數(shù)為0.753，前兩軸解釋群落結(jié)構(gòu)變化達(dá)到37.7%。#2和#4各時(shí)間段樣品分別位于第一軸左右兩端，說明#2和#4各時(shí)間點(diǎn)對(duì)環(huán)境適應(yīng)的特點(diǎn)上相似；#1位于第二軸下端；#3則交替沿第二軸分布，說明#3各時(shí)間點(diǎn)樣品適應(yīng)環(huán)境的能力不同。NH4-N和pH與群落結(jié)構(gòu)之間呈現(xiàn)了較好的相關(guān)性，數(shù)值分別為0.549 5和-0.472 1，通過Monte Carlo法檢驗(yàn)后顯示，p值分別為0.02和0.016，皆達(dá)到顯著水平(p<0.05)。NO2-N、NO3-N和時(shí)間與AOB群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性較低，且沒達(dá)到顯著水平(p>0.05)。根據(jù)最大相關(guān)性得出結(jié)論，pH和NH4-N對(duì)AOB群落分布結(jié)構(gòu)影響顯著[27-28]。

3 結(jié)論

底泥表層AOB群落結(jié)構(gòu)隨著各形態(tài)氮釋放通量變化而不斷變化；PCR-DGGE技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間的變化，AOB群落在第9 d或13 d群落多樣性最豐富，這也是實(shí)驗(yàn)?zāi)M過程中，NH4-N釋放通量在開始的前9 d迅速減小，NO2-N釋放通量在13 d內(nèi)濃度達(dá)到最高值的主要原因；4個(gè)點(diǎn)位的AOB群落結(jié)構(gòu)在圖上分別成簇出現(xiàn)，同一點(diǎn)位各時(shí)間段在主成分上無明顯差異；pH和NH4-N對(duì)AOB和NOB群落分布結(jié)構(gòu)影響顯著。