2 種稀釋液對公豬精液冷凍保存效果的影響

楊 凱，徐 嚴，余開文，李菊芬，李琦華，李 麗

（1.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院，云南 昆明 657206；2.云南滇東獵人農(nóng)林開發(fā)有限公司，云南 昭通 657000；3.云南省昭通市昭陽區(qū)畜牧獸醫(yī)技術(shù)推廣服務(wù)中心，云南 昭通 657000）

隨著養(yǎng)豬業(yè)的不斷發(fā)展進步，人工授精技術(shù)在養(yǎng)豬業(yè)上取得成功，并在很大程度上提高了養(yǎng)豬業(yè)的養(yǎng)殖效益。然而，人工授精技術(shù)的推廣離不開對豬精液進行長期有效的保存。因此，解決豬精液長期保存問題成為人工授精技術(shù)得以廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。1956年，Polge等[1]首次成功進行豬精液的冷凍和保存，并利用人工授精技術(shù)獲得仔豬。盡管豬精液冷凍保存技術(shù)已經(jīng)取得很大的進展，但與牛、羊相比，豬冷凍精液的生產(chǎn)難度大，精液冷凍保存活率低，受胎率和產(chǎn)仔數(shù)不如鮮精液[2]，導(dǎo)致豬冷凍精液很難廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，同時也制約了我國地方豬的改良和地方養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。近幾年，由于非洲豬瘟的傳播，很多地方養(yǎng)殖企業(yè)面臨嚴重威脅。為防止非洲豬瘟傳播而導(dǎo)致的地方豬減少生長面臨滅絕的問題，本研究通過比較2種豬精液冷凍稀釋液、解凍液及冷凍-解凍程序?qū)ωi精液冷凍效果的影響，以期獲得最佳的豬精液冷凍稀釋液、解凍稀釋液配方及冷凍-解凍程序，為地方豬養(yǎng)殖企業(yè)豬冷凍精液的生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

云南農(nóng)業(yè)大學后山實習豬場1頭性成熟、體質(zhì)健康、性欲旺盛的滇南小耳豬。

1.2 儀器

HH-4 電熱恒溫水浴鍋、303-1B 電熱恒溫培養(yǎng)箱、DGS-280C高壓滅菌鍋、IMS-60制冰機、AK-RO-C2超純水機、LC-LX-H165A 低溫高速離心機、SK2009H3 生物顯微鏡、4 ℃BC18 風冷式陳列柜、BCD-118S 冰箱、85-2 磁力攪拌器、PHS-3C pH 計、FA2004N 電子天平、101-2B 干燥箱、8807探針式低溫溫度計、Discovery-10000S移液槍、采精器械等。

1.3 試劑

Ⅰ號精液稀釋液試劑包括原精稀釋液粉（AndroPro?Plus）、冷卻保護稀釋液粉（AndroPro?CryoGaurdTM）、乳化劑（Equex STM paste）、甘油、解凍稀釋粉（AndroPro?CryoGaurdTM-Tham），由德國米尼圖公司生產(chǎn)，購自北京田園奧瑞公司；Ⅱ號精液稀釋液試劑包括乳糖、青霉素、甘油，Ⅱ號稀釋液解凍劑包括葡萄糖、氯化鈉、氯化鉀、碳酸氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸卡那霉素，由云南農(nóng)業(yè)大學蜂學樓實驗室提供。

1.4 稀釋液的配制

在磁力攪拌器上使用量筒準確量取超純水于燒杯中，使用電子天平按照稀釋液配方準確稱取各試劑，溶解于燒杯中，過濾，分裝于50 mL 離心管中配制成Ⅰ號冷凍稀釋液原精稀釋液，放于4 ℃冰箱保存；按配方比例往燒杯中加入超純水、試劑及無蛋白卵黃充分溶解；放于離心機上800 r/min 離心1 h，過濾，分裝于50 mL 離心管中配制成Ⅰ號冷凍稀釋液冷卻液，于4 ℃冰箱保存。Ⅱ號冷凍稀釋液的冷卻稀釋液按配方進行配制，按比例加入無蛋白蛋黃，離心機800 r/min 離心1 h，過濾分裝，保存于4 ℃冰箱。Ⅰ號、Ⅱ號冷凍稀釋液的解凍液按配方進行配制、步驟同上、待酸堿度穩(wěn)定后分裝于50 mL 離心管中放入4 ℃冰箱保存。采精前1 d，將配好的Ⅰ號、Ⅱ號冷凍稀釋液的冷卻液按配方比例加入甘油，并在磁力器上攪拌溶解配制成Ⅰ號、Ⅱ號冷凍稀釋液的冷凍液，保存于4 ℃冰箱備用。兩種冷凍稀釋液配方見表1、表2。

表1 Ⅰ號精液冷凍稀釋液、解凍液配方Tab.1 Ⅰnumber Frozen diluent,defrost liquid formula

表2 Ⅱ號冷凍稀釋液、解凍液配方Tab.2 Ⅱnumber Frozen diluent,defrost liquid formula

1.5 精液采集

手握法采集公豬精液，采精前先準備好紗布和預(yù)熱至約36 ℃的套入保鮮袋的集精杯，使用消毒液擦洗公豬包皮，采精后選擇中段精液使用4層紗布過濾，并用生物顯微鏡觀察精子的活力、形態(tài)，選擇精子形態(tài)正常、活力70%以上、無異味、色澤乳白色、密度大的精液放入保溫壺中，2 h內(nèi)帶回實驗室進行試驗。

1.6 精液的稀釋與平衡

稀釋前先將精液預(yù)熱至32～35 ℃，用移液槍取10 μL于載玻片上，加蓋玻片，并在200倍生物顯微鏡下觀察精子活力，再用移液槍取10 μL 精液注入事先配好的盛有1.99 mL 的3.0%氯化鈉溶液的試管內(nèi)混勻，成為200 倍的稀釋精液，將備好的血細胞計數(shù)板用血蓋玻片蓋好計數(shù)室，用移液槍移取稀釋精液于血蓋玻片邊緣，使稀釋精液自行流入計數(shù)室，均勻充滿；同樣的方法給另一計數(shù)室加樣，靜置5 min，在200 倍生物顯微鏡下觀察并計數(shù)兩個計數(shù)室各5個中方格的精子數(shù)，取平均值。

Ⅰ號冷凍稀釋液稀釋與平衡程序采用三步稀釋法，把原精稀釋液預(yù)熱至32～35 ℃，按1∶1 的比例與采集的精液混合進行稀釋，稀釋后放于2 5℃條件下平衡1～2 h，再放于17 ℃條件下平衡2 h，把稀釋后的精液分裝入50 mL 離心管中，在溫度為17 ℃、離心力為800 g 的條件下離心12～20 min，吸去上清液；然后用預(yù)熱至17 ℃的Ⅰ號冷卻稀釋液與17 ℃下層沉淀精液1∶1混合均勻，將重懸浮后的精子置于盛有適量17 ℃水的燒杯中，放于4 ℃低溫風冷式陳列柜中降溫平衡2.5～3 h 使精液緩慢降溫至4～5 ℃，并在4～5 ℃下繼續(xù)平衡0.5～1 h，再等溫加入與重懸浮后精液體積相等的Ⅰ號冷凍稀釋液，輕輕晃動混勻后立即在5 ℃低溫環(huán)境下用0.25 mL 的麥角細管灌裝封口，并在細管托架上碼好。

Ⅱ號冷凍稀釋液稀釋與平衡程序采用兩步稀釋法，先將采集的精液分裝入50 mL離心管中，在溫度為17 ℃、離心力為800 g 的條件下離心12～20 min，吸去上清液；然后用預(yù)熱至17 ℃冷卻的Ⅱ號冷卻稀釋液與17 ℃下層沉淀精液1∶1混合均勻，將重懸浮后的精子置于盛有適量17 ℃水的燒杯中，放于4 ℃低溫風冷式陳列柜中降溫平衡2.5～3 h使精液緩慢降溫至4～5 ℃；并在4～5 ℃下繼續(xù)平衡0.5～1 h，再等溫加入與重懸浮后精液體積相等的Ⅱ號冷凍稀釋液，輕輕晃動混勻，立即在5 ℃低溫環(huán)境下用0.25 mL的麥角細管灌裝封口，每管灌入0.2 mL 精液，麥角細管事先做好標記放在5 ℃低溫環(huán)境中，封好口的麥角細管立即在細管托架上碼好，并計時熏蒸。

1.7 精液的冷凍

精液的冷凍采用液氮冷凍熏蒸法，Ⅰ號、Ⅱ號冷凍稀釋液精液冷凍步驟一致，將可上下調(diào)動的細管冷凍架置于盛有液氮且標記好刻度線的自制冷凍泡沫箱內(nèi)，調(diào)節(jié)細管托架使細管距液氮面4 cm熏蒸10 min，將麥角細管封口向上直接投入裝有液氮的液氮罐中保存。按上述方法再封裝一批細管，調(diào)節(jié)細管托架使細管距液氮面5 cm，熏蒸10 min 后將麥角細管封口向上直接投入裝有液氮的液氮罐中保存。

1.8 精液的解凍及活力檢測

從液氮中取出冷凍24 h以上的精液麥角細管，迅速放入37 ℃水浴鍋中，0.25 mL 麥角細管冷凍精液水浴解凍30 s，使用衛(wèi)生紙擦干細管，把管中氣泡輕搖到封口段，在氣泡處剪開，開口向上，翻轉(zhuǎn)細管把精液流入預(yù)先預(yù)熱至37 ℃解凍液中，0.25 mL麥角細管冷凍精液加入4.5 mL解凍液中，平衡5～20 min，移取一滴解凍液里的精液于37 ℃載玻片上，并在200倍生物顯微鏡下進行精子活力檢測。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)使用Excel 16.0處理，使用SPSS 25.0軟件進行成對樣本t檢驗，結(jié)果以“平均值±標準”差表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同冷凍稀釋劑對凍精活力的影響（見表3、表4）

表3 細管距液氮面4 cm時不同冷凍稀釋劑對凍精活力的影響Table 3 Effect of different cryo-diluents on the vitality of frozen sperm when the thin tube is 4 cm away from the liquid nitrogen surface 單位：%

表4 細管距液氮面5 cm時不同冷凍稀釋劑對凍精活力的影響Tab.4 Effect of different cryo-diluents on the vitality of frozen sperm when the thin tube is 5 cm away from the liquid nitrogen surface 單位：%

由表3、4 可知，精子凍前活力Ⅰ號冷凍稀釋液試驗組與Ⅱ號冷凍稀釋液試驗組差異不顯著（P>0.05）；當細管距液氮熏蒸面4 cm時，精子凍后活力Ⅰ號冷凍稀釋液試驗組顯著高于Ⅱ號冷凍稀釋液試驗組（P<0.05）；當細管距液氮熏蒸面5 cm時，Ⅰ號冷凍稀釋液試驗組精子凍后活力顯著高于Ⅱ號冷凍稀釋液試驗組（P<0.05）。

2.2 不同液氮面熏蒸距離相同冷凍稀釋劑對凍精活力的影響（見表5）

由表5可知，Ⅰ號冷凍稀釋液配方稀釋冷凍精液后，細管距液氮熏蒸面5 cm 試驗組精子凍后活力高于細管距液氮熏蒸面4 cm 試驗組，但差異不顯著（P>0.05）；Ⅱ號冷凍稀釋液配方稀釋冷凍精液后，細管距液氮熏蒸面5 cm試驗組精子凍后活力高于細管距液氮熏蒸面4 cm試驗組，但差異不顯著（P>0.05）。

表5 不同液氮面熏蒸距離相同冷凍稀釋劑對凍精活力的影響Tab.5 Effect of different liquid nitrogen surface fumigation distance and the same cryo-diluent 單位：%

3 討論

目前，學者們對冷凍稀釋液的配方持有不同的意見，導(dǎo)致豬凍精稀釋液配方成分很不統(tǒng)一。但是，總體而言，豬精液冷凍稀釋液配方部分成分是一致的，如基本以糖作為稀釋劑，甘油作為冷凍保護劑，各類霉素作為抗生素。糖作為稀釋劑在豬精液冷凍稀釋液中的作用非常重要，但濃度不能太高，否則會損害精子的頂體，導(dǎo)致凍精活力下降[3]。張樹山等[4]研究發(fā)現(xiàn)，在豬凍精稀釋液中添加海藻糖、葡萄糖、乳糖三種雙糖3.5 g/100 mL對精液的冷凍保護效果好。目前，家畜中常用的冷凍保護劑是甘油，由于物種不同，添加比例不同。江中良等[5]研究表明，在冷凍稀釋液中添加2～4 mL 的甘油，對凍精的保護效果較好。精液采集和保存過程中會受到污染，臨床上常添加青霉素、鏈霉素等殺滅精液冷凍保存過程中可能出現(xiàn)的有害菌[6]。

本試驗對比2 種冷凍稀釋液對精子凍后活力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Ⅰ號冷凍稀釋液凍精效果顯著優(yōu)于Ⅱ號冷凍稀釋液。Ⅱ號冷凍稀釋液配方中本應(yīng)加入1.5%的OEP，但因無法購得該試劑，因此導(dǎo)致配方中缺少OEP，這可能是Ⅱ號冷凍稀釋液凍精活力較低的原因。目前，OEP是豬精液冷凍稀釋液中常用的一種添加劑。周佳勃等[7]研究發(fā)現(xiàn)，在冷凍稀釋液配方中添加1%的OEP，細管法冷凍豬精子的活力提高6%，同時能使精子的活率、彎尾率和頂體完整率明顯提高。杜立銀等[8]研究發(fā)現(xiàn)，將OEP作為冷凍稀釋液配方中的添加劑的確提高解凍后豬精子的活力。殷方芝[9]研究發(fā)現(xiàn)，添加0.5%OEP能提高豬凍精活力。上述研究表明，OEP 在豬冷凍稀釋液配方中非常重要，冷凍稀釋液中缺少OEP 會導(dǎo)致凍精活力降低。生產(chǎn)中應(yīng)保證豬冷凍稀釋液配方中OEP的添加，以使解凍后的精子保持較高活力，利于人工授精的成功概率。

本試驗采用2 種稀釋方法，Ⅰ號液冷凍稀釋液采用三次稀釋法，Ⅱ號冷凍稀釋液采用二次稀釋法。二次稀釋法少了原精稀釋環(huán)節(jié)，雖然可以降低母豬輸精過程中精子的用量[10]，但這種方法不利于長距離運輸后制作凍精。本次試驗采集的精液經(jīng)一定距離運輸回實驗室進行試驗，可能就是本次試驗中Ⅱ號冷凍稀釋液冷凍精液效果顯著低于Ⅰ號液冷凍稀釋液冷凍精液效果的原因之一。目前，比較常用的是三次稀釋法，適用于各種細管的冷凍。夏天等[11]采用三次稀釋細管法制作豬凍精，解凍后活力較高，給6頭母豬輸精后，得到9.16 頭的產(chǎn)仔數(shù)，表明三次稀釋法在細管凍精中的效果好。

精液在冷凍保存過程會受到熱、機械、化學和滲透壓的影響，從而導(dǎo)致活力大幅度下降[12]。另外，冷凍速率也會影響豬精液的冷凍的效果，冷凍過慢、過快都會使精子被破壞。禚艷書等[13]研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mL 細管適宜冷凍速率為50 ℃/min。細管精液的冷凍方法、細管距液氮面的距離及細管冷凍時間也會影響凍精活力。禚艷書[14]研究發(fā)現(xiàn)，凍精細管冷凍時采用液氮熏蒸法冷凍的效果較直接投入液氮好。液氮熏蒸時間過短、過長均會影響凍精活力，高俊鋒等[15]研究發(fā)現(xiàn)，0.25 mL 細管在液氮面熏蒸10 min再投入液氮獲得最佳的冷凍效果。章嘯君等[16]對金華豬精液進行液氮熏蒸冷凍，也得出液氮熏蒸10 min再投入液氮有較好的冷凍效果。細管距液氮面的距離也會影響凍精活力，但各種報道得到的結(jié)果并不一致。劉運鎮(zhèn)[17]研究發(fā)現(xiàn)，細管距液氮面3 cm的冷凍效果優(yōu)于1 cm和5 cm，張偉[18]研究發(fā)現(xiàn)，細管距液氮面4 cm時冷凍效果較好。本試驗中，兩種冷凍稀釋劑均采用0.25 mL 細管和10 min 液氮熏蒸法。但由于距液氮熏蒸面距離不一樣，解凍后的活力也有所差異。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細管距液氮面5 cm 時，兩種冷凍稀釋液的冷凍效果優(yōu)于細管距液氮面4 cm 的冷凍效果，但差異不顯著。解凍溫度和時間對凍精的活力也有影響。大量研究表明，0.25 mL 細管的凍精解凍溫度和時間為37 ℃、30 s 時，凍精解凍后的活力最佳[19-21]。本試驗兩種冷凍稀釋劑解凍溫度和時間為37 ℃、30 s，確保凍精解凍時活力達到最佳。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，使用Ⅰ號冷凍稀釋液進行豬精液冷凍的效果較好，且細管距液氮熏蒸面5 cm 時，凍精解凍后精子的活力較高；Ⅱ號冷凍稀釋液冷凍的豬精液活力較低，主要原因可能是沒有添加OEP，造成解凍后精子活力較低，同時可能由于自制冷凍泡沫箱未密封好，造成液氮熏蒸時溫度有波動，導(dǎo)致精液冷凍效果降低。