高效液相色譜法檢測豬肉中4 種氟喹諾酮類藥物殘留方法的優(yōu)化

田雨超，谷學(xué)佳，薛 麗

（1.北京市昌平區(qū)農(nóng)產(chǎn)品監(jiān)測檢測中心，北京 102200；2.北京市大興區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動物疾病控制中心，北京 102600）

喹諾酮類藥物（4-quinolones）是人工合成抗菌藥，以抑制細(xì)菌的DNA回旋酶為機(jī)理，抗菌作用強(qiáng)大，抗菌譜較廣。一般將這類藥物分為4代，從第3代開始加入氟原子，稱為氟喹諾酮類。至今已經(jīng)有20個氟喹諾酮類藥物品種上市，大多用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。氟喹諾酮類藥物在獸醫(yī)臨床上最常用的有諾氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氧氟沙星、丹諾沙星、馬波沙星等[1]。氟喹諾酮類藥物常見的不良反應(yīng)為幼畜軟骨變性，大量使用會產(chǎn)生結(jié)晶損傷尿道及胃腸道反應(yīng)。這類藥物的不正確使用和不遵循休藥期會導(dǎo)致藥物殘留，也會使致病菌產(chǎn)生耐藥性，間接危害人類健康[2]。該藥物長期大量累積會造成肝損害，危及生命。多個國家和地區(qū)均規(guī)定了氟喹諾酮類藥物的最高殘留限量[3]。國外對動物食品中喹諾酮類藥物殘留的研究主要集中在前處理方法以及新材料的應(yīng)用，或者開發(fā)對多種類藥物殘留的一次性綜合檢驗(yàn)新方法，如微生物法的應(yīng)用等[4-7]；而國內(nèi)研究則集中在樣品前處理方法的條件優(yōu)化上，一般標(biāo)準(zhǔn)方法的操作步驟及色譜條件[8]，很多細(xì)節(jié)甚至關(guān)鍵步驟需要操作者在實(shí)際應(yīng)用中去摸索。標(biāo)準(zhǔn)方法經(jīng)改進(jìn)細(xì)化，不僅成本較低、前處理簡單易行，而且給基層操作者帶來方便和可應(yīng)用性參考。根據(jù)基層檢測單位的實(shí)際情況，為節(jié)省成本和提高工作效率，優(yōu)化色譜條件和簡化前處理步驟成為首選改進(jìn)因素。目前，在動物產(chǎn)品的檢測中，很多推薦使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。但由于基層單位儀器設(shè)備條件有限，《動物性食品中氟喹諾酮類藥物殘留檢測高效液相色譜法》（農(nóng)業(yè)部1025 號公告-14-2008）[9]成為基層單位主要檢測方法。本試驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，簡單細(xì)化了試驗(yàn)前處理步驟，優(yōu)化了檢測過程，減少所需耗材較大幅度降低成本，尤其對大批量樣品檢測，節(jié)省了處理時間。本方法的靈敏度和回收率均可滿足我國現(xiàn)行獸藥殘留檢測分析的要求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)使用的豬肉購自二商大紅門五肉聯(lián)，經(jīng)檢測，樣品均不含諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星、沙拉沙星藥物殘留。

1.2 儀器與試劑

高效液相色譜儀1260（熒光檢測器）（安捷倫）、B-400組織搗碎機(jī)（瑞士步琦）、GT10-1高速臺式離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司）、CAX-371 高速冷凍離心機(jī)（TOMX）、ME104E/02 天平（Mettler Toled）、TTL-DCII 氮吹儀、MX-F 漩渦振蕩器（Scilogex）、LPD2500 多管混合儀（萊普特科學(xué)儀器（北京有限公司））、Eppendorf 微量移液器（Thermo Finnpiptte）、KS康氏振蕩器；PHS-3C pH計(jì)（雷滋）、ME55 型電子天平（瑞士梅特勒－托利多儀器有限公司）、超聲波儀、Waters固相萃取柱HLB（3 mL）。

乙腈、甲醇、異丙醇（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；磷酸（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；三乙胺（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸二氫鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氯化鉀（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；氫氧化鈉（分析純，北京化工廠）；超純水；蒸餾水（屈臣氏）。

標(biāo)準(zhǔn)品：達(dá)氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度94.27%；恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度99.00%；環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度92.31%；沙拉沙星標(biāo)準(zhǔn)品，純度85.82%，均購自Dr.Ehrenstorfer GmbH。

1.3 試液配制

環(huán)丙沙星、恩諾沙星是光敏性藥物，應(yīng)避光保存。配制過程中應(yīng)在暗處進(jìn)行，防止藥物光解，配制完后儲存在棕色避光瓶中。

分別稱取對照品恩諾沙星10.00 mg、環(huán)丙沙星11.10 mg、沙拉沙星10.95 mg，置于同一個10 mL 容量瓶中，使用0.03 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解定容至刻度，制得質(zhì)量濃度均為1 g/L 的混合儲備溶液。準(zhǔn)確稱取達(dá)氟沙星對照品達(dá)氟沙星12.69 mg，0.03 mol/L 的氫氧化鈉溶液溶解定容至10 mL，使其質(zhì)量濃度為1 g/L，置2～8 ℃冰箱中保存，備用，有效期3個月。取上述恩諾沙星、環(huán)丙沙星和沙拉沙星的混合儲備液1.00 mL，達(dá)氟沙星儲備液0.20 mL，置于同一個10 mL 容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配置成恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星的質(zhì)量濃度為100 mg/L，達(dá)氟沙星質(zhì)量濃度為20 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取上述混合儲備液1.00 mL，置于1 個10 mL 容量瓶中，使用乙腈定容至刻度，配置成恩諾沙星、環(huán)丙沙星、沙拉沙星的質(zhì)量濃度為10 μg/mL，達(dá)氟沙星質(zhì)量濃度為2 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。使用流動相配制成所需要濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以備使用，標(biāo)液配制稀釋級不要太大，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度盡量不要從上一濃度梯度稀釋，避免標(biāo)液配制出現(xiàn)偏差。

5.0mol/L 氫氧化鈉溶液：取氫氧化鈉飽和液28 mL，加水稀釋至100 mL，混勻（根據(jù)需要適量配制）。

0.03mol/L 氫氧化鈉溶液：取5.0 mol/L 氫氧化鈉液0.6 mL，加水稀釋至100 mL，混勻。

磷酸/三乙胺溶液：取濃磷酸3.4 mL，加水稀釋1 000 mL，使用三乙胺調(diào)pH 值至2.4?，F(xiàn)用現(xiàn)配（易產(chǎn)生沉淀）。

磷酸鹽緩沖溶液（用于肌肉、脂肪組織）：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水溶解并稀釋至500 mL，使用5.0 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0。

洗脫液：取乙腈20 mL，使用0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液稀釋至100 mL，混勻。取乙腈18 mL，使用0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液稀釋至100 mL混勻，備用。

1.4 樣品處理

稱?。?.00±0.02）g 豬肉樣品，加10.0 mL 磷酸鹽緩沖液（pH 值=7），渦旋混勻，中速振蕩5 min，10 000 r/min 離心，取上清液到新離心管待用，再向原離心管加磷酸鹽緩沖液10.0 mL，渦旋混勻，中速振蕩5 min，10 000 r/min 離心，2次上清液合混勻，使用濾紙過濾，備用。

標(biāo)記好的固相萃取柱先依次用甲醇、磷酸鹽緩沖液各2 mL預(yù)洗。取上清液5 mL過柱，使用1 mL水淋洗，擠干。用流動相1 mL洗脫，擠干，收集洗脫液。經(jīng)過濾膜過濾后作為試樣溶液，供高效液相色譜法測定。

1.5 色譜條件

流動相A為0.05 mol/mL磷酸溶液/三乙胺，D為乙腈，使用前過濾脫氣；流速0.8 mL/min，柱溫：室溫，進(jìn)樣量：20 μL；熒光檢測器，激發(fā)波長（Kex）248 nm，發(fā)射波長（Kem）450 nm。色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18 柱（250 mm×4.6 mm，5μm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 樣品制備環(huán)節(jié)

一般基層檢測樣品量大，普通的樣品粉碎機(jī)費(fèi)時費(fèi)力，且得到均質(zhì)效果不理想的樣品，只能通過勻漿機(jī)進(jìn)一步均質(zhì)。在通過實(shí)踐和同其他機(jī)構(gòu)借鑒經(jīng)驗(yàn)，本試驗(yàn)使用的瑞士步琦組織搗碎機(jī)B-400，30 s可以制備好樣品，樣品顆?？蛇_(dá)0.3 mm，甚至可以大塊冷凍樣品處理。

檢測中可以直接稱取上述制備樣品，節(jié)省了勻漿步驟。本方法在樣品制備過程中已經(jīng)達(dá)到勻漿機(jī)效果，還避免2次勻漿造成藥物損失，減少勻漿操作步驟時間。

2.1.2 組織提取液凈化

動物源食品中基質(zhì)干擾復(fù)雜，富含大量脂肪和蛋白質(zhì)，因此對豬肉樣品選擇要求瘦肉不含有筋膜樣品，但實(shí)際檢測中有時無法得到理想樣品。按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部的方法，樣品組織提取液一般不干凈呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，直接加到固相萃取柱，會堵塞小柱，大大增加凈化時間，并且造成藥物回收率低、不穩(wěn)定，導(dǎo)致準(zhǔn)確率降低、殘留檢測難度增大。離心時采用高速冷凍離心機(jī)，低溫可使脂肪凝固，還能減少藥物因?yàn)殡x心過程中溫度過高帶來的損失。一般使用乙腈飽和的正己烷溶液去除脂肪等干擾物質(zhì)，效果雖然較好，但是多了一步有機(jī)試劑，費(fèi)時、費(fèi)力、成本提高。本試驗(yàn)采用上述方法進(jìn)行上清液用濾紙過濾，可以過掉大部分殘?jiān)?，用濾紙過濾需要過柱體積的上清混合液回收率較高，不影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。經(jīng)過濾后4 種農(nóng)藥回收率提高7.7%～13.9%，提高了過柱速度。

本試驗(yàn)選用固相萃取，填充劑基質(zhì)是聚合物，作用和效果同C18（填充劑基質(zhì)是硅膠）的固相萃取小柱，具有高吸附容量，實(shí)際工作中活化和淋洗液體積可適當(dāng)調(diào)整并不影響回收率。

2.1.3 試劑配制和材料準(zhǔn)備（見表1）

試驗(yàn)過程中，從標(biāo)準(zhǔn)品、提取液和凈化液配制到流動配制相都需要操作者自己配制，每個細(xì)微環(huán)節(jié)都會直接影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。標(biāo)液配制過程中根據(jù)《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》及GB/T 601—2002《化學(xué)試劑標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》確定選用合適量程的天平，稱取量要根據(jù)化學(xué)式及純度進(jìn)行換算以去除鹽酸根。標(biāo)準(zhǔn)中只有在標(biāo)準(zhǔn)曲線配制時提到了用流動相配制，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)建議小于1 mg/L 均用流動相配制，否則峰型不好，尤其對環(huán)丙沙星影響明顯會使峰分叉。

配制時溶液用水的不同，也會影響藥物提取回收率。由表1可知，本試驗(yàn)比較一級水和蒸餾水，一級水配制磷酸鹽提取液回收率提高了3.3%～11.0%。

表1 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化Tab.1 Optimization of sample preparation conditions

由于色譜系統(tǒng)的精密性和對結(jié)果分析的準(zhǔn)確性要求，對樣品的過濾顯得尤為重要，過濾可以保護(hù)色譜柱系統(tǒng)和色譜柱，延長柱子的使用壽命，改善數(shù)據(jù)的精確度。過濾可以清除由于摩擦長生顆粒而引起的壓力波動和無規(guī)律的雜質(zhì)引起的極限波動，可以消除由于存在氣泡對檢測系統(tǒng)的干擾。本試驗(yàn)比較尼龍膜和聚偏氟乙烯膜（PVDF）。PVDF 膜使藥物提取效率提高了3.3%～8.9%，尤其對達(dá)氟沙星明顯提高。

2.2 色譜條件的選擇（見圖1、圖2）

圖1 流動相20∶80色譜圖Fig.1 Chromatogram of mobile phase 20∶80

圖2 流動相18∶82色譜圖Fig.2 Chromatogram of mobile phase 18∶82

由圖1、圖2 可知，流動相中乙腈的比例越高，4 種目標(biāo)物保留時間越短?？紤]到干擾雜質(zhì)的出峰時間和各峰的分離度，選擇乙腈和水相的體積比為20∶80（標(biāo)準(zhǔn)流動相乙腈和水相的比例18∶82）。0.1 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液測得環(huán)丙沙星的保留時間為4.848 min，達(dá)氟沙星為5.255 min，恩諾沙星為5.976 min，沙拉沙星為8.862 min，峰形尖銳，分離完全，無干擾峰出現(xiàn)。在相同色譜條件下，本試驗(yàn)得到的保留時間比標(biāo)準(zhǔn)方法提前3.4 min。此條件下，樣品標(biāo)液添加回收也得到同樣色譜峰，沒有樣品基質(zhì)干擾。

2.3 方法的線性范圍與檢出限（見表2）

表2 方法的線性范圍與檢出限Tab.2 Linear range and detection limit of the method

由表2 可知，環(huán)丙沙星、恩諾沙星、沙拉沙星在5～500 μg/L濃度范圍內(nèi)，達(dá)氟沙星在1～100 μg/L線性關(guān)系良好。本試驗(yàn)采用通過大量分析樣品空白樣品，獨(dú)立測試次數(shù)大于10 次，計(jì)算檢測結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差（S），方法檢出限結(jié)果表示為：樣品空白值+4.65 S。

2.4 方法的回收率與精密度（見表3）

表3 方法的回收率與精密度Tab.3 Method recovery and precision

空白豬肉待測樣品中分別添加3個濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)液，各6個平行。由表3可知，環(huán)丙沙星3個濃度回收率在76.5%～101.8%，變異系數(shù)在1.8%～3.8%，批間變異系數(shù)為3.2%～5.6%；達(dá)氟沙星回收率在80.8%～87.8%，變異系數(shù)在1.3%～1.7%，批間變異系數(shù)為2.8%～6.6%；恩諾沙星回收率在77.5%～107.9%，變異系數(shù)在2.2%～6.4%，批間變異系數(shù)為5.2%～7.8%；沙拉沙星回收率在66.1%～88.7%，變異系數(shù)在1.6%～4.5%，批間變異系數(shù)為4.5%～7.1%?；厥章始芭鷥?nèi)變異系數(shù)均在方法要求內(nèi)。

3 結(jié)論

目前，大多檢測方法包含樣品制備、提取、凈化和濃縮。在提取同時把與蛋白質(zhì)結(jié)合的藥物解吸附成游離藥物，凈化時除去樣品中的干擾雜質(zhì)，濃縮時達(dá)到儀器可檢測的濃度范圍。本試驗(yàn)在原有方法基礎(chǔ)上根據(jù)實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有條件在各個步驟中尋找可以改進(jìn)優(yōu)化的點(diǎn)。本試驗(yàn)選擇豬肉組織，基本組成為水分、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物、礦物質(zhì)、維生素和酶類等，相對雞肉、牛肉及豬肝等樣品雜質(zhì)干擾較少。不同組織的功用不同，在結(jié)構(gòu)特點(diǎn)上存在差異，這些變化可能影響某些藥物的回收率和干擾的檢測選擇并優(yōu)化樣品前處理方法對結(jié)果的準(zhǔn)確性尤為重要。

高效液相色譜法在喹諾酮類藥物殘留的檢測中被廣泛應(yīng)用，農(nóng)業(yè)部1025 號公告-14-2008 也是各檢測單位常用的方法。本試驗(yàn)以此標(biāo)準(zhǔn)為基礎(chǔ)，簡化了試驗(yàn)前處理步驟，優(yōu)化了檢測過程。經(jīng)多次主要證明改進(jìn)后優(yōu)化后的方法成本降低、通用性強(qiáng)、方法靈敏度和回收率均可滿足我國現(xiàn)行獸藥殘留檢測分析的要求，可為基層檢測單位提供參考。