豬塞內卡病毒全基因組分析及系統(tǒng)進化樹構建

崔慧綺，趙司淼，冉旭華，聞曉波

（海南大學動物科技學院海南省熱帶動物繁育與疫病研究重點實驗室，海南 ?？?570228）

A型塞內卡病毒（seneca virus A，SVA），又稱為塞內卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV），是小核糖核酸病毒科塞內卡病毒屬的唯一成員，且只有一種血清型。SVA為單股正鏈、無囊膜的RNA病毒，呈典型的二十面體對稱結構[1]。

SVA 是近幾年來在全球范圍內流行的豬原發(fā)性水皰病（porcine idiopathic vesicular disease，PIVD）的病原體，其癥狀與口蹄疫、水皰性口炎和豬水皰病的臨床癥狀相似，且難以區(qū)分。在臨床上，感染豬口腔黏膜、鼻部、鼻腔、遠端肢體，特別是蹄冠部位趾間皮膚紅腫、發(fā)熱，然后發(fā)白，形成不規(guī)則大小各異的水皰[2]；通常表現(xiàn)為厭食、嗜睡、跛行、水皰病變[3]。該病毒對成年豬的影響較小，但對新生仔豬危害較大，容易引起新生仔豬的突發(fā)性死亡[3]，嚴重影響新生仔豬的存活率，對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。2002 年，該病毒由馬里蘭州蓋瑟斯堡的一家遺傳治療中心意外從胎兒的成視網(wǎng)膜細胞（C6）中分離得到，并將其命名為塞內卡谷病毒（SVV）[4]，之后對SVA原型毒株的研究主要集中在其抗腫瘤活性方面[5]。起初，對SVA 感染所導致的臨床癥狀、病理變化、傳播方式以及流行病學特點和診斷方法等方面的研究均十分有限；同時，因為最初發(fā)現(xiàn)的SVA的感染率、發(fā)病率都較低，引起自限性疾病且臨床癥狀輕微，主要在加拿大、美國散發(fā)，分布位置十分有限，所以并未引起廣大學者的重視。2007年，加拿大首次在馬尼巴托省發(fā)現(xiàn)SVA導致的豬水皰病的病例[6]，并在2008年首次獲得了SVA可能與豬水皰病相關的證據(jù)，2012 年美國也報道了由SVA導致豬原發(fā)性水皰病的病例。自2014 年以來，在巴西[7]、中國[8]、泰國[9]、哥倫比亞[10]等國家均相繼出現(xiàn)關于SVA引起的豬水皰病疫情的報道。2015年后，SVA感染所致臨床癥狀明顯加重，同時還可導致新生仔豬大量死亡，從而引起專家學者的高度重視。

目前我國對SVA的研究尚處于起步階段，因此對目前發(fā)現(xiàn)的典型SVA毒株進行遺傳進化分析，有助于了解該病毒的進化路線，為相關疫苗開發(fā)和疾病防控提供參考。通過遺傳進化分析可以了解該病毒在全世界的流行與分布趨勢，甚至在一定程度上能夠推測某些國家和地區(qū)所發(fā)現(xiàn)毒株的來源，以此追溯該毒株的流入途徑，有助于預防新發(fā)病毒毒株的傳入，有助于疾病防控，以此降低該病對養(yǎng)豬業(yè)的危害，提高畜牧業(yè)的經濟效益。

1 材料與方法

1.1 塞內卡病毒序列的獲取

本研究從NCBI（national center for biotechnology information）網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫中下載SVA的全基因組序列。選取其中的220條序列作為研究對象。為了保證樣本的覆蓋范圍，提高研究結果的普遍性與準確性，研究中所有毒株均分離自1988 年至2019 年間，分離地域及數(shù)量為美國106株、中國81株、加拿大13株、巴西12株、泰國6株、越南1株、哥倫比亞1株。

1.2 多序列比對與重組分析

研究采用MEGA7軟件（molecular evolutionary genetics analysis，Hachioji，Tokyo，Japan）中的MUSCLE 比對方法對序列進行排列，剔除由于片段缺失以至于無法對齊的序列，將剩余條序列裁剪為等長的序列，序列長度為7 150 bp。將完成對齊的序列導入重組分析軟件RDP5（recombination detection program，http://web.cbio.uct.ac.za/～darren/rdp.html）中進行重組分析。選擇軟件中的RDP、GENECONV、Chimaera、MaxChi、BootScan、SiScan 6 種方法對SVA 的全基因組序列進行重組檢測。當6 種方法的結果中出現(xiàn)4個以上陽性信號時，認定重組發(fā)生，并從樣本中剔除該序列，然后再將剩下的數(shù)據(jù)導入軟件中重新檢測，直至最后不再產生4個以上陽性結果的序列。最后留下184條SVA全基因組序列構建系統(tǒng)進化樹。

1.3 核酸替換模型的選擇

組成DNA的脫氧核苷酸序列的突變是促進基因進化的原動力，這種突變也被稱為核酸替代。DNA序列中核苷酸替代數(shù)的估計是測定基因間進化距離的數(shù)學統(tǒng)計方法，是研究基因進化的基礎。最基本的核苷酸序列替代模型包括p-距離模型、Kimura兩參數(shù)模型和Jukes-Cantor模型以及在此基礎上衍生出的一系列其他模型，如Tajima-Nei模型、Tamura 模型、Tamura-Nei 模型等[11]。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，最大似然法（maximum likelyhood method，ML）和貝葉斯法（bayesian inference of phylogeny，BI）均是常用的進化樹構建方法，且兩者均是基于選擇合適的核酸替換模型才能進行遺傳距離計算的方法。因此，核酸替換模型的計算與選擇是構建ML進化樹和BI進化樹必不可少的步驟。

1.4 系統(tǒng)進化樹的構建

本研究使用MEGA7.0.26版本軟件中的最大似然法構建ML 進化樹，參數(shù)設置Bootstrap 檢驗，重復頻率為1 000 次，選擇核酸替換模型為TN93+G+I，置信區(qū)間為95%，其他參數(shù)為默認值。構建完成的ML 進化樹使用FigTree1.4.4 進行編輯。使用MrBayes3.2.4 版本軟件構建BI進化樹，選擇核酸替換模型為默認GTR模型，設置試驗參數(shù)，MCMC 采樣值為10 000，保證在后面的可能性分布中至少取到1 000個樣本。抽樣總次數(shù)為100 000，抽樣頻率為10進行計算。構建完成的BI進化樹使用FigTree1.4.4進行調整。使用Network10.1.0.0構建系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡[12]，使用星聚法（star contraction）對序列進行預處理，選擇中介鄰接網(wǎng)絡法（median joining）計算序列網(wǎng)絡關系，標準選擇FHP 計算，其他參數(shù)選擇默認，將計算出來的結果用最大簡約法（MP）進行簡化處理。

2 結果與分析

重組是正鏈RNA 病毒的一種重要的進化機制，通過形成新的嵌合基因組驅動病毒多樣性的產生。重組對于病毒而言是有利的，如逃避免疫應答、抗病毒治療、改變細胞或宿主的趨向性和自身的致病性[13]。研究表明，在國內SVA已經出現(xiàn)了重組毒株，SVA的遺傳多樣性得到進一步加強[14]。但是，重組的出現(xiàn)會對病毒的遺傳進化分析產生干擾，因此通過RDP5 軟件剔除36 株重組毒株，重組毒株數(shù)量占全部樣本的16.4%。

研究構建了ML進化樹（見圖1）、BI進化樹（見圖2）和系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡（見圖3）。由圖1～圖3 可知，參與進化分析的所有毒株大致分為三大進化支。第一進化支為1988 年至1993 年間僅在美國部分地區(qū)分離的SVA 毒株；第二進化支為1997 年至2008 年間出現(xiàn)的包含SVV-001 在內的典型SVA毒株；第三進化支為2014年往后，該時期內SVA毒株的數(shù)量與流行的范圍均呈爆炸式增長。

ML進化樹和BI進化樹中不同顏色的毒株名稱代表不同的國家。由圖1可知，大多數(shù)的SVA毒株存在明顯的地域屏障，同一國家的毒株聚類在同一分支上；但也存在一些不同國家的分離株聚類在同一分支上的特殊情況。2007年加拿大最早存在的SVA 毒株CNA-SVA-07-503297-2007-MN233023，該毒株與美國明尼蘇達州分離的毒株USA-MN07-00487-MN812944、USA-MN07-00488-MN 812945 序列同源性分別高達99.69%和99.80%。此外，2016 年發(fā)現(xiàn)的哥倫比亞株Colombia-SVA-2016-KX857728 與2015 年美國伊利諾伊州發(fā)現(xiàn)的毒株USASVA-IL-72-1-2015-MH634530 在進化樹上處于同一分支，兩者之間的同源性高達98.65%。2018年發(fā)現(xiàn)的越南毒株VietNam-SVA-3187-2018-MH704432 與2016 年在中國廣西發(fā)現(xiàn)的毒株CHN-SVA-GXI09-2016-KY038016位于進化樹同一分支上，兩者的同源性高達98.64%。

圖1 最大似然法構建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree constructed by maximum likely-hood method

圖1、圖2中五角星標注的本實驗室毒株CHN-SVA1-FL-2019（GenBank登錄號：MN922286.1）與2018年在河南駐馬店發(fā)現(xiàn)的毒株CHN-SVA-HeNZMD-1-2018-MK357115 和2018 年在四川黑水縣發(fā)現(xiàn)的CHNSVA-HS-01-2018-MH588717、CHN-SVA-HS-03-2018-MH817446 在同一進化分支上。毒株CHN-FL-2019 與HeNZMD-1-2018毒株序列同源性為98.22%，與HS-01毒株的同源性達98.33%，與HS-03毒株的同源性為98.16%。比對結果顯示，HS-01 毒株與CHN-SVA1-FL-2019 毒株的同源性最高，但是四川黑水縣的兩毒株與實驗室毒株之間存在0.07%的基因缺失，而實驗室毒株與河南駐馬店毒株的比對中則不存在基因缺失。將實驗室分離毒株CHNFL-2019 與中國最早發(fā)現(xiàn)的SVA 毒株CHN-SVA-CH-01-2015-KT321458 作序列比對，得到兩者的序列同源性為96.39%。將實驗室毒株與美國發(fā)現(xiàn)的典型SVA 毒株SVV-001 進行比對，得到兩者之間的序列同源性為93.78%。CHN-FL-2019 與目前分離的最早存在的毒株USA-SVA-NC88-23626-1988-MN812936 和USA-SVAMN88-36695-1988-MN812937 的同源性分別為90.79%和91.24%。

圖2 貝葉斯算法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree constructed by Bayesian inference

通過對比兩種方法構建的進化樹，發(fā)現(xiàn)在ML 進化樹中，實驗室分離毒株及與其親緣關系較近的毒株單獨存在于一個進化分支中；而在BI進化樹中，該分支還與哥倫比亞毒株分支及美國GBI29-2015 毒株發(fā)生聚類，這些毒株與實驗室毒株CHN-FL-2019 分支的同源性范圍為98.55%～98.62%。

由圖3 可知，隨著時間的推移，SVA 的進化過程可以分為3個階段，分別為散發(fā)階段、過渡階段以及流行階段。進一步了解每個階段包含的毒株，結果與ML方法和BI方法構建進化樹的3個進化支中的毒株是相互對應的，進一步驗證了前面所構建進化樹的準確性，提高了結果的可信度。此外，目前出現(xiàn)的所有SVA 毒株均是以1988 年最早存在的SVA毒株進化而來，所有分支大致均沿一個方向進化，這一結果也與SVA 目前只出現(xiàn)一種血清型的結論相符合。

圖3 Network構建的系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡Fig.3 Phylogenetic network constructed by network

3 討論

本研究中，對從1988 年到2019 年出現(xiàn)的220 株SVA進行全基因組序列的遺傳進化分析，所選序列的數(shù)量達到GenBank 數(shù)據(jù)庫收錄的SVA 全基因組序列的80%以上。本研究構建了ML進化樹、BI進化樹和系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡。在構建進化樹的方法中ML 法是其中較為傳統(tǒng)的統(tǒng)計學方法，也是較為常用的最符合實際的一種建樹方法。貝葉斯方法構建進化樹在病毒遺傳發(fā)育分析上的應用較少，但是計算結果的準確性也很高[15]。研究發(fā)現(xiàn)，這兩種方法構建的進化樹的結果相似，因此可以同時使用兩種方法構建進化樹，并進行比較。兩者相互佐證能夠提高所構建進化樹的可信度。Network構建的系統(tǒng)發(fā)育網(wǎng)絡能夠直觀地將不同毒株之間的進化關系呈現(xiàn)，從而發(fā)現(xiàn)從進化樹中不能發(fā)現(xiàn)的關系。

1988 年至1993 年分離出的是SVA 的原始毒株，僅在美國部分地區(qū)散發(fā)，對豬養(yǎng)殖戶造成的損害較小，故未引起廣泛的關注。2002 年，美國分離出典型毒株SVV-001病毒才被正式命名。2007年之前，SVA只在美國境內存在并散發(fā)。2007 年，加拿大的1 例疾病報告顯示，自加拿大馬尼巴托省運往美國明尼蘇達州的一輛載有生豬的運輸車中發(fā)現(xiàn)了一種特殊的水皰病，該病正是由SVA感染而引起的[6]。本研究中的進化樹顯示，該加拿大毒株確實與明尼蘇達州的兩例SVA 毒株聚類在同一分支上且序列同源性極高。由此可以推測，兩地出現(xiàn)的SVA疫情可能源于兩地之間的生豬貿易，這也是第一次在除美國之外的國家發(fā)現(xiàn)SVA 毒株。自2014 年，SVA 首先在美國本土多個州開始暴發(fā)流行，并逐漸擴散至其他國家，2015 在巴西和中國廣東均出現(xiàn)了SVA引起PIVD的病例，SVA毒株開始跨越了北美洲地域屏障開始在南美洲以及亞洲地域內出現(xiàn)并流行。2016 年，SVA 在哥倫比亞首次出現(xiàn)，有報道稱該病毒與美國的GBI29毒株親緣關系近，從而排除哥倫比亞地區(qū)SVA的流行與巴西毒株的關系[10]。本研究中，哥倫比亞毒株Colombia-SVA-2016-KX857728 與USA-IL-72-1-2015-MH634530 的同源性高達98.65%，較USA-GBI29-2015-KT827251 與哥倫比亞毒株的同源性98.21%更高，而聚類在同一進化分支上，這說明在大數(shù)據(jù)的條件下，能夠得出更精確的結論。2018 年，越南地區(qū)出現(xiàn)了SVA 毒株，報道稱該毒株與中國廣西的毒株親緣關系極近[16]。本試驗中的構建的兩種進化樹得出相同結論。從地理位置上看兩者之間是毗鄰關系，因此越南的SVA毒株很有可能是從中國廣西地區(qū)流入的。

對本實驗室毒株CHN-SVA1-FL-2019的遺傳關系進行分析，發(fā)現(xiàn)該毒株與四川黑水和河南駐馬店市的毒株關系緊密。CHN-FL-2019所在進化分支中的毒株與美國的GBI29-2015 毒株和哥倫比亞分支之間的同源性達到98.5%以上。對比ML 進化樹與BI 進化樹之間的差異，按照BI進化樹的分類將這些毒株聚類在同一進化分支上似乎更為合理。將FL-2019 與2015 年中國最先發(fā)現(xiàn)的SVA毒株、2002 年美國發(fā)現(xiàn)的SVA 典型毒株以及1988 年最早分離的SVA 毒株進行序列同源性比對。結果顯示，F(xiàn)L-2019毒株與三者的序列差異逐漸增大，表明隨著時間的推移，SVA不斷地突變、進化，新出現(xiàn)的毒株與原始毒株之間的同源性越來越低。不同地域內的毒株之間不斷發(fā)生突變和重組，使病毒遺傳信息的不斷更新?lián)Q代。由于生存環(huán)境的差異最終病毒會朝著不同的方向進化，進化分支也越來越多樣化。未來很有可能隨著SVA 的擴散與流行而出現(xiàn)新的血清型。

RNA病毒在傳播過程中具有很強的環(huán)境適應能力，主要依賴其進化過程中的遺傳多樣性[14]。RNA 作為遺傳物質的穩(wěn)定性不如DNA，因此RNA 病毒復制過程中很容易造成基因的引入替換、插入和缺失。通過RNA 片段的重組可以實現(xiàn)基因的廣泛改變，這一過程可以導致病毒表型產生極端變化，例如逃避免疫反應、抗病毒治療、改變細胞或宿主的趨向性以及改變致病性等[17]。對SVA 全基因組序列進行遺傳進化分析能夠充分了解SVA 的進化路程及其遺傳背景。了解目前世界各地SVA 的分布及其流行情況能夠為后續(xù)疫苗的篩選制備提供依據(jù)。由進化樹的結果可知，SVA 的進化過程具有明顯的地域局限性，但也存在跨國家聚類的現(xiàn)象，可能與國家之間的豬肉或生豬的進出口貿易有關。Joshi等[18]在出現(xiàn)SVA疫情的豬養(yǎng)殖場內的老鼠以及蒼蠅體內檢測到SVA的抗體，且核酸檢測結果為陽性，表明老鼠或蒼蠅等可能作為傳播媒介推動SVA的流行。有研究在出現(xiàn)PIVD癥狀的豬排出的尿液中檢測到SVA的核酸，表明尿液也可能是SVA傳播的一種途徑[19]。

海南省由于其特殊的地理位置，是多種動物疫病的無疫區(qū)。2018年，代蕾等[20]對海南省15個市（縣）112個規(guī)模養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶豬群采集血清進行SVA抗體檢測，發(fā)現(xiàn)檢測場點中SVA陽性率為50.0%，樣品陽性率為10.9%，說明SVA 不僅已擴散至海南省，并且在快速擴散流行。因此，國家對SVA相關疾病的防控提出了新要求，不僅要加強國家貿易進出口農畜產品的檢驗檢疫工作，還需要加強生豬進出口檢疫。此外，隨著SVA 在世界各地日益流行，對生豬養(yǎng)殖產業(yè)造成的危害日益嚴重，疫苗研發(fā)刻不容緩。因此，本研究對從當前流行毒株中篩選合適的疫苗候選株具有重大參考意義。但是，具體疫苗株的篩選還需對毒株進行病毒活性、穩(wěn)定性以及免疫原性等方面的檢測。

4 結論

塞內卡病毒遺傳進化歷程以時間為界分為3 個進化支。隨著時間的推移，每個進化支中含有的SVA毒株數(shù)量逐漸遞增，SVA 的分類逐漸細化，病毒的進化方向趨于多樣化。