6 種食用玫瑰染色體核型分析及基因組大小測定

段登文，許 彬，孟 靜

（云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院，云南 昆明 650201）

食用玫瑰為薔薇科薔薇屬植物，不僅具有較高的觀賞價值，而且具有藥用價值和經(jīng)濟價值，同時也是世界馳名的香料、配料。我國食用玫瑰種植具有悠久的歷史，山東平陰、甘肅苦水、新疆和田、貴州安順、云南八街等地均種植不同品種的食用玫瑰[1]。隨著研究的擴展和深入，食用玫瑰品種越來越多，且以其為原料的產(chǎn)品也層出不窮，逐漸成為一種消費新時尚。其中，較為常見的油食兼用品種有平陰1號、四季玫瑰、大馬士革等[2]；而金邊、墨紅、滇紅等具有生長勢強、抗病蟲害中等、產(chǎn)量高的優(yōu)點，并且花瓣可食用，也可用于加工薰茶、制醬、釀酒等[3]。

染色體特征對研究植物系統(tǒng)演化、親緣關(guān)系、物種起源、進化與分類及雜種染色體鑒定具有重要意義。薔薇屬植物染色體基數(shù)為7[4-5]，且染色體倍性復雜多樣，從二倍體到八倍體不等，有些還存在混倍體[6]，復雜多樣的染色體組型雖然為品種選育提供了豐富的種質(zhì)資源，但是也出現(xiàn)了因雜交不親和而導致育種周期長等問題。因此，為了更好地利用種質(zhì)資源，更有效地培育食用玫瑰新品種，研究種質(zhì)資源染色體核型等細胞學特征尤為必要[7-9]。

基因組大小或稱C 值，是指一個物種的配子體細胞核中染色體未進行復制時的DNA 含量。C 值是一個很重要的植物學特征，是植物學家進行種群進化、物種分類和生態(tài)學研究的有效依據(jù)[10]。迄今為止，測定基因組大小的方法主要有3 種：孚耳根微顯影、基因組測序法以及流式細胞術(shù)（FCM）[11]。其中，流式細胞術(shù)具有高效率、準確度高、樣品制備方便、分析快等特點，是測定植物基因組大小的首選方法。以往報道中，吳鈺瀅等[12]、李詩琦等[13]和丁曉六等[14]利用流式細胞術(shù)成功測定出部分薔薇屬植物的基因組大小，并推測其倍性水平。

目前，國內(nèi)外關(guān)于食用玫瑰的研究較多，主要集中于栽培技術(shù)[15-16]、色素[17-18]、玫瑰精油及有機成分[19-21]等方面，而關(guān)于染色體核型分析及基因組大小的文獻較少[22-25]。該研究采用常規(guī)壓片法對6 種食用玫瑰品種進行染色體壓片，觀察其染色體形態(tài)，進行核型分析，并采用流式細胞術(shù)測定核DNA 含量與基因組大小，為食用玫瑰引種、培育和改良工作以及開發(fā)新品種提供參考與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為平陰1 號、四季玫瑰、金邊、墨紅、大馬士革和滇紅這6 種食用玫瑰品種，均種植于云南農(nóng)業(yè)大學苗圃內(nèi)。

1.2 試驗方法

1.2.1 染色體制片上午8：00—10：00，取無病蟲害的頂芽2～5 mm，輕輕刮除外表皮及絨毛，在蒸餾水中用刀片切至薄片，置于濃度為0.002 mol/L 的8-羥基喹啉溶液中，放入0～4℃的冰箱中預處理2～3 h，蒸餾水清洗4～5 次后用配制的卡諾固定液（V無水乙醇∶V冰醋酸= 3 ∶1）固定8～24 h，再次洗凈，放入5 mol/L HCl 中常溫解離10 min。漂洗后放置于載玻片中央，滴加1 滴改良的苯酚品紅染液染色2 h，吸去多余染色液，用帶橡皮擦的鉛筆輕敲蓋玻片，使細胞分散均勻，將壓片放于60℃烘箱處理5～8 min，以減少水分對觀察的影響。將處理過的壓片放在低倍光學顯微鏡下，選取分散較好的區(qū)域，調(diào)至100 倍鏡下選取30個分散良好、染色體形態(tài)清晰的分裂中期細胞進行拍照及分析。

1.2.2 流式細胞術(shù)取樣品嫩葉約1 g，蒸餾水洗凈表面的塵土，濾紙吸干后放入預冷的培養(yǎng)皿中，將樣品置于0.8 mL 預冷的mGb 解離液，用鋒利的刀片將組織迅速垂直切碎，使其在解離液中冰上靜置10 min，然后用400 目濾網(wǎng)過濾，得到細胞核懸浮液。采用適當體積且濃度均為50 μg/mL 預冷的碘化丙啶和RNAase 溶液，置于冰上避光染色0.5～1.0 h。將染色后的細胞核懸浮液樣品上 BD FACSCalibur 流式細胞儀檢測，采用488 nm 藍光激發(fā)，檢測碘化丙啶的發(fā)射光熒光強度，每次檢測收集10 000 個顆粒，每個待測樣品設(shè)2 個重復，變異系數(shù)CV（%）控制在5%以內(nèi)，使用Modifit 3.0 分析軟件作圖分析。以已明確的日本晴水稻及番茄為內(nèi)參，將待測樣品的熒光信號強度與其對比，判斷倍性并通過進一步計算得到基因組大小。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選取良好分散的染色體用LAS EZ 軟件在Leica DM500 顯微鏡下捕獲圖像，利用Photoshop CS 6 進行圖片處理及配對，采用ImageJ1.80 進行染色體長短臂的測量，采用Excel 2010 軟件進行數(shù)據(jù)處理，分析染色體核型并建立染色體核型模式圖。使用ModiFit 3.0軟件分析得到流式細胞儀分析圖。按照李懋學等[26]提出的核型分析標準以及Levan 等[27]的兩點四區(qū)命名系統(tǒng)對染色體形態(tài)劃分歸類，染色體核型分類按Stebbins[28]的方法來進行，染色體核型不對稱系數(shù)按Arano[29]的方法計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 染色體數(shù)目及核型分析

從圖1、圖2 可以看出，6 種食用玫瑰品種染色體基數(shù)x= 7。其中平陰1 號和四季玫瑰為二倍體，染色體數(shù)目均為2n= 2x= 14；金邊和墨紅是三倍體，染色體數(shù)目均為2n= 3x= 21；大馬士革和滇紅是四倍體，染色體數(shù)目均為2n= 4x= 28。進一步對染色體形態(tài)測量計算，得到染色體核型參數(shù)（表1）。6 種試材的染色體均靠中部和近中部著絲點區(qū)，未發(fā)現(xiàn)隨體染色體，基本由m、sm 組成。核型不對稱系數(shù)范圍在55.19%～60.00%之間。其中，平陰1 號核型公式為2n=14 = 12m+2sm，核型不對稱系數(shù)為60%，1A 核型；四季玫瑰核型公式為2n= 2x= 12m+2sm，核型不對稱系數(shù)為57.00%，1B 核型；金邊核型公式為2n=3x= 21m，核型不對稱系數(shù)為55.19%，1B 核型；墨紅核型公式為2n= 3x= 17m+4sm，核型不對稱系數(shù)為57.30%，2C 核型；大馬士革核型公式為2n= 4x=26m+2sm，核型不對稱系數(shù)為56.07%，1B 核型；滇紅核型公式為2n=4x=24m+4sm，核型不對稱系數(shù)為56.68%，2B 核型。

圖1 6 種食用玫瑰品種部分鏡檢圖。

圖2 6 種食用玫瑰品種核型模式圖

2.2 6 種食用玫瑰核DNA 含量與基因組大小

對6 種食用玫瑰品種核DNA 含量以及基因組大小進行檢測，結(jié)果如圖3 所示，變異系數(shù)（CV）控制在5%以內(nèi)。由表2 可知，6 種食用玫瑰試材的2C值變化范圍為0.91～2.18 pg，1C 值變化范圍為0.45～0.73 pg，2C 值最小的為二倍體種平陰1 號，基因組大小為（444.07±16.12）Mbp，最大的是四倍體種墨紅，基因組大小為（1 066.75±2.97）Mbp。

表2 6 種食用玫瑰品種核DNA 含量和基因組大小

圖3 6 種食用玫瑰品種流式細胞分析圖。

表 1 6 種食用玫瑰品種染色體參數(shù)

3 結(jié)論與討論

染色體數(shù)目及特征是重要的生物學數(shù)據(jù)，同一物種或品種的染色體數(shù)目恒定，對于闡述植物進化程度和相近種親緣關(guān)系具有重要意義[30-31]，研究染色體數(shù)目可以為食用玫瑰遠緣雜交親本的選擇提供依據(jù)，在種質(zhì)創(chuàng)新方面也具有一定的參考價值。該研究分析了平陰1 號、四季玫瑰、金邊、墨紅、大馬士革、滇紅6 種食用玫瑰品種的倍性、核型分析參數(shù)、核DNA含量以及基因組大小。結(jié)果表明，6 種食用玫瑰品種染色體基數(shù)均為7，且未發(fā)現(xiàn)隨體染色體，這與前人研究結(jié)果一致[32]。四季玫瑰染色體核型為二倍體、1B 核型，與招雪晴[22]和馬雪[33]的研究結(jié)果一致；大馬士革為四倍體，與蹇洪英等[24]和Jian 等[25]的研究結(jié)果一致，但Roberts 等[34]的研究顯示該品種為三倍體，導致這種差異的原因可能是供試材料本身存在差異；其余4 種試材之前未見報道。依據(jù)Stebbins[28]的研究，在植物界中，高等植物染色體核型進化的基本走向是從對稱向不對稱發(fā)展的，在系統(tǒng)演化上具有相對對稱核型的植物比較古老或原始，而常見衍生或進化比較高級的植物具有不對稱核型。研究結(jié)果顯示，6 種食用玫瑰品種染色體核型不對稱系數(shù)由高到低依次為平陰1 號（60%）＞墨紅（57.3%）＞四季玫瑰（57%）＞滇紅（56.68%）＞大馬士革（56.07%）＞金邊（55.19%），由此可知，金邊比較原始，平陰1號進化比較先進。

對薔薇屬核DNA 含量、C 值和倍性水平進行大規(guī)模的估計，不但能為野生物種的分類和系統(tǒng)研究提供核學信息，而且還可為薔薇屬植物資源的育種和遺傳改良利用提供核學信息。對Jian 等[25]、Roberts 等[34]和Yokoya 等[35]關(guān)于薔薇屬1C 值的數(shù)據(jù)進行整理，發(fā)現(xiàn)二倍體種1C 值范圍為0.37～0.89 pg，三倍體種為0.51～0.76 pg，四倍體種為0.46～0.68 pg，該研究的6種食用玫瑰試材均處于上述范圍內(nèi)。平陰1 號與四季玫瑰都是利用雜交手段培育而成的玫瑰品種，其中平陰1 號母本為單瓣紅玫瑰（R. rugosa），父本為重瓣紅玫瑰（R.rugosa‘Plena’）[36]；四季玫瑰母本為山刺玫（R.davuricaPall），父本為重瓣紅玫瑰[37]。雖然關(guān)于上述2 個品種的基因組大小還未有報道，但前人研究顯示玫瑰的1C 值為0.57 pg[34]和（0.58±0.07）pg[25]，與該研究中平陰1 號[（0.45±0.02）pg]和四季玫瑰（0.51 pg）的數(shù)值相比偏高，導致這種偏差的原因可能是2個食用玫瑰品種雜交親本基因組偏小，也可能是供試材料之間的差異。Roberts 等[34]曾報道了大馬士革的1C 值為0.59 pg，高于該研究中大馬士革的1C 值（0.51 pg），推測產(chǎn)生偏差的原因可能是供試材料本身存在差異，也可能是因為地理條件和倍性水平不同而發(fā)生了雜交，導致其自身遺傳信息存在個體差異。

食用玫瑰營養(yǎng)豐富、用途廣泛，具有很高的開發(fā)價值和廣闊的應用前景。國外食用玫瑰產(chǎn)業(yè)發(fā)展較好的有保加利亞、土耳其、印度和法國等，但隨著我國經(jīng)濟的快速增長，人民生活水平的不斷提高，我國已成為僅次于歐盟的第二大玫瑰消費地區(qū)，食用玫瑰的地位和作用也日趨拓寬，滲透到社會生活的多個領(lǐng)域[38]。該研究采用常規(guī)壓片法，對6 種食用玫瑰品種染色體數(shù)目進行觀察與核型分析，在一定程度上為食用玫瑰品種的倍性與核型研究提供了參考，為后續(xù)食用玫瑰品種的種質(zhì)資源鑒定、系統(tǒng)演化研究及多樣性改良提供了基礎(chǔ)。此外，該研究利用流式細胞術(shù)快速測定了6 種試材的基因組大小，為后續(xù)AFLP 引物中選擇性堿基個數(shù)的確定提供了依據(jù)，同時豐富了薔薇屬植物的C 值庫，并為薔薇屬其他物種基因組大小測定方法提供了借鑒。