長春新堿通過lncRNA XIST/miR-485-5p調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的分子機(jī)制

劉 宇，李 延，雷玉榮

（陜西省延安市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，延安 716000）

宮頸癌是臨床常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率與死亡率占據(jù)我國女性腫瘤第二位，腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡異常與宮頸癌形成有關(guān)，目前宮頸癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明，因而深入探究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制有助于提高治療效果及改善患者預(yù)后。研究表明，中藥治療具有副作用小且療效好等特點，并可成為治療腫瘤的重要方法之一。已有研究證實，小柴堿等具有抗宮頸癌的作用[1-3]。長春新堿是長春花提取物，屬于二聚吲哚類生物堿，其具有抗腫瘤作用，研究表明，長春新堿可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。但長春新堿對宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其作用機(jī)制的研究報道較少。長鏈非編碼RNA（lncRNA）在宮頸癌等腫瘤中異常表達(dá)，并可能作為治療的潛在靶點，研究表明，lncRNA XIST 與miR-200a競爭性結(jié)合而上調(diào)Fus表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)展[5]。靶基因預(yù)測顯示lncRNA XIST與miR-485-5p存在結(jié)合位點，miR-485-5p通過靶向survivin抑制乳腺癌的進(jìn)展[6]?；诖?，本研究旨在探討長春新堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響及其對lncRNA XIST/miR-485-5p的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 藥物和主要試劑 長春新堿購自上海華聯(lián)制藥有限公司（純度＞98%）；宮頸癌細(xì)胞HeLa購自湖南豐暉生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；Lipofectamine 2000、MTT 試劑、Matrigel 基質(zhì)膠購自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室購自美國Corning 公司；miR-NC、miR-485-5p mimics、si-NC、si-lncRNA XIST購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA 購自武漢淼靈生物科技有限公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；反轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green 試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9 抗體購自美國CST 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 實驗分組 HeLa細(xì)胞分別培養(yǎng)于含有不同濃度（0.02 μmol/L、0.04 μmol/L、0.08 μmol/L）長春新堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h[7]，分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。pcDNA-NC、pcDNA-lncRNA XIST、miR-NC、miR-485-5p mimics 分別轉(zhuǎn)染入HeLa 細(xì)胞，分別記為pcDNA-NC組、pcDNA-lncRNA XIST組、miR-NC組、miR-485-5p 組。轉(zhuǎn)染過程參照Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。分別將pcDNANC、pcDNA-lncRNA XIST、miR-NC、miR-485-5p mimics、miR-NC 與pcDNA-lncRNA XIST、miR-485-5p mimics 與pcDNA-lncRNA XIST分別轉(zhuǎn)染入HeLa細(xì)胞后加入含濃度為0.08 μmol/L長春新堿的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，分別記為pcDNA-NC+高劑量組、pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組、miR-NC+高劑量組、miR-485-5p+高劑量組、miR-NC+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組、miR-485-5p+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期HeLa細(xì)胞（1×106個/mL），接種于96 孔板（100 μL/孔），各孔加入MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，室溫避光孵育5 min后用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度（OD）值。

1.4 Transwell 實驗檢測細(xì)胞遷移與侵襲 收集各組HeLa 細(xì)胞（2.5×105個/mL）接種于小室的上室（200 μL/孔），小室的下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，采用PBS洗滌，加入多聚甲醛固定20 min，采用PBS 洗滌后加入0.1%結(jié)晶紫染液染色10 min，觀察遷移細(xì)胞數(shù)。采用預(yù)冷培養(yǎng)液稀釋Matrigel 基質(zhì)膠后加入上室（40 μL/孔），于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育5 h，后續(xù)實驗同細(xì)胞遷移實驗，觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.5 qPCR 法檢測細(xì)胞lncRNA XIST、miR-485-5p的表達(dá) 采用Trizol法提取各組HeLa細(xì)胞總RNA，應(yīng)用Nanodrop2000c 超微量分光光度計檢測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min；95℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算lncRNA XIST、miR-485-5p 相對表達(dá)量。XIST 正向引物5’-GTCCCCCAGCAGGCTTTATC-3’，反向引物5’-GAAAAGTGAGTGAAGGAGTA-3’；U6 正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3’，反向引物5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’；βactin 正向引物5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’，反向引物5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’；miR-485-5p 正向引物5’-CAGCCAGAGTTAGCAATAGG-3’，反向引物5’-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3’。

1.6 雙熒光素酶報告基因檢測lncRNA XIST 和miR-485-5p 的靶向關(guān)系 Starbase 預(yù)測顯示lncRNA XIST和miR-485-5p存在結(jié)合位點，將含有結(jié)合位點的片段克隆至pmirGLO 載體得到野生型載體lncRNA XIST-WT，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點進(jìn)行突變，將含有突變結(jié)合位點的片段克隆至pmirGLO載體得到突變型載體lncRNA XIST-MUT，miR-NC、miR-485-5p mimics 分別與lncRNA XISTWT、lncRNA XIST-MUT 共轉(zhuǎn)染入HeLa 細(xì)胞，于培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，采用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

1.7 Western blotting 法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá) 收集各組HeLa細(xì)胞，加入500 μL RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度后，煮沸使蛋白變性，取蛋白樣品（50 μg）進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗稀釋液（均1:1 000）后置于4 ℃條件下孵育24 h，采用TBST洗滌后加入二抗稀釋液（1:2 000）后置于室溫條件下孵育1 h，滴加ECL顯影，應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長春新堿抑制宮頸癌細(xì)胞HeLa 增殖、遷移和侵襲 與NC 組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組細(xì)胞活力（OD）值降低（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），見表1。

表1 長春新堿抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

表1 長春新堿抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲

與NC組比較，*P＜0.05。

2.2 長春新堿抑制宮頸癌細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá) 與NC組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖1、表2。

圖1 Western blotting 檢測宮頸癌細(xì)胞CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

表2 長春新堿抑制宮頸癌細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)

表2 長春新堿抑制宮頸癌細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白的表達(dá)

與NC 組比較，*P＜0.05；與低劑量組比較，#P＜0.05；與高劑量組比較，ΔP＜0.05。

2.3 長春新堿對lncRNA XIST 和miR-485-5p 表達(dá)的影響 與NC 組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組lncRNA XIST的表達(dá)水平降低（P＜0.05），miR-485-5p的表達(dá)水平升高（P＜0.05），見表3。

表3 長春新堿對lncRNA XIST和miR-485-5p表達(dá)的影響

表3 長春新堿對lncRNA XIST和miR-485-5p表達(dá)的影響

與NC組比較，*P＜0.05。

2.4 lncRNA XIST 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與pcDNA-NC組比較，pcDNA-lncRNA XIST組細(xì)胞活力升高（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC+高劑量組比較，pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組細(xì)胞活力升高（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多（P＜0.05），CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高（P＜0.05），見圖2、表4。

表4 lncRNA XIST高表達(dá)逆轉(zhuǎn)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

表4 lncRNA XIST高表達(dá)逆轉(zhuǎn)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

與pcDNA-NC組比較，*P＜0.05；與pcDNA-NC+高劑量組比較，#P＜0.05。

圖2 Western blotting 法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)

2.5 miR-485-5p 高表達(dá)增強(qiáng)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用與miRNC組比較，miR-485-5p組細(xì)胞活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（均P＜0.05）；與miR-NC+高劑量組比較，miR-485-5p+高劑量組細(xì)胞活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（均P＜0.05），見圖3、表5。

表5 miR-485-5p高表達(dá)增強(qiáng)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

表5 miR-485-5p高表達(dá)增強(qiáng)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用

與miR-NC組比較，*P＜0.05；與miR-NC+高劑量組比較，#P＜0.05。

圖3 Western blotting檢測CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達(dá)

2.6 lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-485-5p 的表達(dá) Starbase 預(yù)測顯示lncRNA XIST 和miR-485-5p存在結(jié)合位點，見圖4A。miR-485-5p過表達(dá)可明顯降低野生型載體lncRNA XIST-WT的熒光素酶活性（P＜0.05），而對突變型載體lncRNA XIST-MUT 的熒光素酶活性無明顯影響，見圖4B。與si-NC 組比較，si-lncRNA XIST 組miR-485-5p 的表達(dá)水平升高（P＜0.05）；與pcDNA-NC 組比較，pcDNA-lncRNA XIST 組miR-485-5p 的表達(dá)水平降低（P＜0.05），見圖4C。

圖4 lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-485-5p 的表達(dá)

2.7 miR-485-5p 高表達(dá)逆轉(zhuǎn)lncRNA XIST 高表達(dá)對長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的抑制作用 與miR-NC+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組比較，miR-485-5p+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組細(xì)胞活力降低（P＜0.05），遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少（P＜0.05），CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白水平降低（P＜0.05），見圖5、表6。

表6 miR-485-5p高表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)lncRNA XIST高表達(dá)抑制長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響作用

表6 miR-485-5p高表達(dá)可以逆轉(zhuǎn)lncRNA XIST高表達(dá)抑制長春新堿對宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響作用

與miR-NC+pcDNA-lncRNA XIST+高劑量組比較，*P＜0.05。

圖5 Western blotting 法檢測CyclinD1、MMP2、MMP9 蛋白表達(dá)

3 討論

化療、手術(shù)等是治療腫瘤的主要方法之一，但部分患者對化療藥物產(chǎn)生耐藥性從而降低治療效果，患者預(yù)后較差，既往研究顯示，植物提取物的活性成分具有抗腫瘤的作用，例如，華蟾素可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]?？鄥A可通過上調(diào)BDNF-AS 而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖[9]。人參皂苷Rg3 可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖及上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]。但長春新堿調(diào)控宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的作用機(jī)制尚未闡明。

長春新堿可通過下調(diào)細(xì)胞增殖與周期相關(guān)蛋白表達(dá)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞周期阻滯，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]。長春新堿可誘導(dǎo)舌癌細(xì)胞周期阻滯于細(xì)胞中期，并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[12]。本研究結(jié)果顯示，不同劑量的長春新堿處理后可明顯降低宮頸癌細(xì)胞活力，并可減少遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)。研究表明CyclinD1屬于細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其水平升高可促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。MMP2、MMP9屬于基質(zhì)金屬酶家族成員，可降解細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力[14]。為進(jìn)一步證實長春新堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用，本研究采用Western blot法檢測細(xì)胞增殖、遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，長春新堿可明顯降低宮頸癌細(xì)胞中CyclinD1、MMP2、MMP9 的表達(dá)水平，提示長春新堿可降低宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力。

目前長春新堿影響宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的分子機(jī)制尚未完全闡明，本研究結(jié)果顯示，長春新堿處理的宮頸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST 的表達(dá)水平降低，提示長春新堿可能通過下調(diào)lncRNA XIST 的表達(dá)而發(fā)揮作用。lncRNA XIST/ miR-34a 軸通過MET-PI3K-AKT 信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)甲狀腺癌的細(xì)胞增殖和腫瘤生長[15]。lncRNA XIST下調(diào)表達(dá)通過激活miR-335/SOD2/ROS信號途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而抑制非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展[16]。lncRNA XIST 通過miR-133a/EGFR 促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖[17]。本研究結(jié)果顯示，lncRNA XIST 過表達(dá)后可明顯提高宮頸癌細(xì)胞活力，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，lncRNA XIST過表達(dá)與長春新堿聯(lián)合作用后宮頸癌細(xì)胞活力升高，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，提示lncRNA XIST 過表達(dá)可明顯降低長春新堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用。本研究證實lncRNA XIST 可競爭性結(jié)合miR-485-5p，并可負(fù)向調(diào)控miR-485-5p的表達(dá)。LncRNA LINC00460 通過調(diào)節(jié)LINC00460/miR-485-5p/ Raf1 軸而促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的進(jìn)展[18]。miR-485-5p通過靶向CX3CL1抑制骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和增殖[19]。miR-485-5p 通過阻斷WBP2/Wnt 信號通路抑制肝癌的進(jìn)展[20]。本研究結(jié)果顯示，長春新堿處理的宮頸癌細(xì)胞中miR-485-5p的表達(dá)水平升高，進(jìn)一步研究顯示，miR-485-5p 過表達(dá)可明顯降低細(xì)胞活力，降低遷移及侵襲能力，miR-485-5p 過表達(dá)與長春新堿聯(lián)合作用后細(xì)胞活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，提示miR-485-5p 過表達(dá)可明顯增強(qiáng)長春新堿對宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的作用。分析其原因可能為長春新堿可降低宮頸癌細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST 的表達(dá)水平，lncRNA XIST 可競爭性結(jié)合miR-485-5p 而負(fù)向調(diào)控miR-485-5p 的表達(dá)，長春新堿可通過調(diào)控lncRNA XIST的表達(dá)而上調(diào)miR-485-5p 的表達(dá)從而發(fā)揮作用。同時，本研究采用miR-485-5p過表達(dá)、lncRNA XIST過表達(dá)與長春新堿聯(lián)合處理宮頸癌細(xì)胞，結(jié)果顯示，細(xì)胞活力降低，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)減少，提示長春新堿可通過調(diào)控lncRNA XIST/miR-485-5p 而影響宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的生物學(xué)行為。

綜上所述，長春新堿可通過降低lncRNA XIST的表達(dá)水平而提高miR-485-5p 的表達(dá)水平從而抑制宮頸癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，lncRNA XIST/miR-485-5p 可能作為長春新堿治療宮頸癌的潛在靶點，可為進(jìn)一步揭示宮頸癌發(fā)病機(jī)制奠定實驗基礎(chǔ)，還可能為宮頸癌治療藥物的研發(fā)提供新方向。