秋水仙堿磷脂復(fù)合物的制備及質(zhì)量評價*

麥琬婷，韋妍妍，黃煦日，黃秋潔，葉 勇Δ

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)教研室,南寧 530021；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,南寧 530001）

肝纖維化是肝臟對持續(xù)性肝損傷的修復(fù)愈合反應(yīng)的病理產(chǎn)物，其主要病理特征是肝臟內(nèi)細胞外基質(zhì)的過度沉積[1]。秋水仙堿（Colchicine，Col）是一種卓酚酮類生物堿，它主要用于治療痛風(fēng)[2]、抗腫瘤[3]和抗纖維化[4-5]等。但是，Col治療指數(shù)范圍窄[6]，治療劑量和中毒劑量接近[7]，有研究表明，Col 超過0.8 mg/kg，會導(dǎo)致多器官衰竭[8]。要提高其臨床應(yīng)用，通常通過改善脂溶性，降低半數(shù)抑制濃度，起到增效減毒作用。

磷脂是細胞膜的主要成分，具有毒性低、生物相容性好等特點，可以通過細胞膜和細胞質(zhì)而不會干擾細胞的正常生理活動[9]。藥物磷脂復(fù)合物是藥物分子和磷脂分子通過電荷遷移作用而形成的更為穩(wěn)定的復(fù)合物或絡(luò)合物[10]，可同時增加藥物的脂溶性和水溶性,增加進入體循環(huán)的量，提高藥物的生物利用度[11]。本研究旨在篩選具有較高復(fù)合率的秋水仙堿復(fù)合物（colchicine phospholipid complex，Col-PC）的制備工藝并進行表征，改善Col油水分配系數(shù)和半數(shù)抑制致死率，降低Col的治療劑量，從而提高生物利用度，為Col 新型靶向給藥制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器

十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多國際貿(mào)易[上海]有限公司，XS205DU）；數(shù)顯磁力攪拌器（上海秋佐科學(xué)儀器有限公司，DF-101Z）；ODS C18（250mm×4.6mm，5μm）（月旭科技[上海]股份有限公司，Welchron-C18）；高效液相色譜儀（日本島津公司，LA-20A）；冷凍干燥器（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司，F(xiàn)D-1D-50）；差示掃描量熱儀（日本島津制作所，DSC-60A）；臺式恒溫振蕩儀（廣州航信科學(xué)儀器有限公司，THZ-92C）；倒置顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社，奧林巴斯CKX-41）；數(shù)顯三用恒溫水浴箱（國華電器有限公司，HH-6）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（德國Thermo Forma 公司，Model311）；超潔凈凈化工作臺（蘇州設(shè)備總廠，1450型）

1.2 試劑

秋水仙堿原料（上海源葉生物科技有限公司，X17J7Y16262）；秋水仙堿對照品（成都瑞芬思生物科技有限公司，Q-006-170426）；精制蛋黃卵磷脂E80（德國LIPOID[上海東尚]公司，510300-2153732/923）；色譜純甲醇（賽默飛世爾科技[中國]有限公司，166753）；無水乙醇（分析純）（廣東光華科技股份有限公司，20180102）；石油醚（分析純）（成都市科隆化學(xué)品有限公司，2017061601）；正辛醇（分析純）（天津市大茂化學(xué)試劑廠，20180108）；MTT（美國Sigma 公司，XBB6865V）；DMSO（北京索萊寶科技有限公司，1213C0223）

1.3 Col-PC的制備

用無水乙醇溶解Col 和磷脂，攪拌反應(yīng)2 h，溫度40 ℃，再加入適量石油醚溶解Col-PC，完全沉淀游離的Col后，用0.45μm微孔濾膜過濾除去游離藥物，濾液在40 ℃時旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去石油醚。將所得殘余物（磷脂復(fù)合物）經(jīng)冷凍凍干24 h，取出，研磨粉碎，過100目篩，避光、密封、存放于陰涼干燥處。

1.4 Col-PC含量測定方法的建立

1.4.1 色譜條件

ODS C18（250 mm×4.6 mm，5μm）色譜柱；流動相為甲醇∶水=56∶44（V∶V）；流速為1 mL/min，檢測波長為352 nm；進樣體積為10μL。

1.4.2 復(fù)合率的測定

精密稱取適量的Col，記為W總，制備成磷脂復(fù)合物，用無水乙醇配制成適當(dāng)濃度，作為供試液；再精密稱取適量的Col 對照品，用無水乙醇配制成24μg/mL 對照品溶液。分別精密量取供試液和對照品溶液各10μL，按照“1.4.1色譜條件”測定，記錄峰面積，計算藥物含量，記為W復(fù)，復(fù)合率按照下面公式1計算：

1.4.3 標準曲線的繪制

精密稱定Col 對照品，加無水乙醇溶解配制成一定濃度，分別稀釋為2.4μg/mL、4.8μg/mL、12μg/mL、24μg/mL、48μg/mL和60μg/mL，按照“1.4.1色譜條件”測定，記錄峰面積，以峰面積A 對濃度C 進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.4.4 精密度試驗

分別制備2.4 μg/mL、24 μg/mL、60 μg/mL 低、中、高3個質(zhì)量濃度的Col乙醇溶液按照“1.4.1色譜條件”測定，記錄峰面積，各重復(fù)測定3次，考察精密度。

1.4.5 穩(wěn)定性試驗

取同一份24 μg/mL 對照品溶液，于0 h，1 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，按照“2.2.1色譜條件”測定，計算日內(nèi)誤差。

1.4.6 準確度試驗

取磷脂適量，分別加入相當(dāng)標示量的80%、100%、120%的Col對照品，平行制備3次，用無水乙醇溶解并稀釋成相應(yīng)濃度的供試液，按照“2.2.1 色譜條件”測定，計算回收率。

1.5 正交試驗

通過查閱文獻得知，對Col-PC的形成影響較大的因素有反應(yīng)溶劑用量（A）、反應(yīng)物投料比（B）及反應(yīng)溫度（C），按L9（33）表設(shè)計試驗，以復(fù)合率為指標優(yōu)化處方。因素與水平，見表1。

表1 正交因子表

1.6 驗證試驗

以最優(yōu)處方制備3 批FATM-SLN，測定3 批樣品，精密稱取Col 20.01 mg，磷脂124.87 mg，共同溶于無水乙醇40 mL 中，置于恒溫磁力攪拌器中，在40℃下充分攪拌反應(yīng)2.0 h，然后旋轉(zhuǎn)除去無水乙醇，再加入適量石油醚充分溶解Col-PC，用0.45μm微孔濾膜過濾，除去未反應(yīng)的Col，將所得殘余物（Col-PC）經(jīng)冷凍干燥24 h，取出，研磨粉碎，計算復(fù)合率。結(jié)果顯示，3 批樣品的復(fù)合率分別為88.5%、89.1%、88.9%，平均值為88.83%，RSD為0.003%。

1.7 Col-PC的理化性質(zhì)考察

1.7.1 差示掃描量熱法（DSC）

稱取3 mg 左右的樣品，裝入鋁坩堝中，把樣品壓平整，置于壓樣機中，蓋上坩堝蓋，旋轉(zhuǎn)壓片機扳手，封好樣品；不放樣品，壓制一個空坩堝作為參比樣品，放入儀器中進行檢測，檢測條件為：以每分鐘10 ℃升溫，在25～250 ℃范圍內(nèi)掃描，以N2為保護氣體，流速為60 mL/min。樣品為：Col、Col-PC、磷脂及兩者物理混合物，繪制各樣品的DSC圖。

1.7.2 表觀油水分配系數(shù)的測定

取適量正辛醇和超純水，于臺式恒溫震蕩器震蕩24 h，轉(zhuǎn)移至250 mL 分液漏斗，靜置過夜，分液，上層為水飽和正辛醇溶液，下層為正辛醇飽和水溶液。

用水飽和的正辛醇溶解Col、Col-PC 及其物理混合物，配成一定的濃度。精密吸取0.5 mL 置于10 mL 的離心管，再取4 mL 正辛醇飽和的水溶液，封口，在25 ℃臺式恒溫振蕩儀振蕩6 h，于轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，時間為10 min 離心，取下層水溶液，用無水乙醇配成適當(dāng)?shù)臐舛?，按照?.4.1色譜條件”測定，得到C水。將溶解藥物的正辛醇溶液配成適當(dāng)?shù)臐舛?，按照?.4.1色譜條件”測定，得到C總。即按公式2得C油，按公式3得表觀油水分配系數(shù)P。

1.8 體外細胞毒性試驗

將生長至對數(shù)期活化的HSC-T6 細胞以每孔（6×100）～（7×100）個的密度接種于96 孔板上，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基，加入不同濃度的Col和Col-PC的DMSO 溶液（DMSO 的質(zhì)量分數(shù)＜0.1%），每個質(zhì)量濃度平行5 組，同時設(shè)不加藥的空白組，繼續(xù)放回培養(yǎng)箱培養(yǎng)，48 h后每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），在培養(yǎng)箱中孵育4 h后，吸去上清液，每孔加100 μL DMSO，避光，放置于搖床振蕩10 min，使用酶標儀測定各孔在570 nm 處的吸光度值，記錄實驗結(jié)果，并按公式4 計算平均抑制率。

2 結(jié)果

2.1 Col-PC含量測定方法的建立

2.1.1 標準曲線的繪制

Col在2.4～60.0μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：A=9 854.8C-1987 0，r=0.999 9。

2.1.2 精密度試驗

RSD%分別為0.20%、1.98%、0.71%，均小于2%，精密度符合要求。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗

Col溶液的日內(nèi)誤差的RSD為1.56%，小于2%，說明Col溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

2.1.4 準確度試驗

Col 對照品的回收率80%，100%，120%的RSD分別為0.23%、1.45%、1.95%，均小于2%，表明該方法準確度好。

2.2 正交試驗

按照表1的正交試驗設(shè)計得出結(jié)果，見表2。為了確定顯著性因子，對表2 進行方差分析和顯著性檢驗，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，3種因素對Col-PC的復(fù)合率的影響大小依次為B＞A＞C。A、B 和C 因素對Col-PC 的制備均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），由此得出制備Col-PC的最佳條件為A2B3C3。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.3 驗證試驗

3批樣品的復(fù)合率分別為88.5%、89.1%、88.9%，平均值為88.83%，RSD為0.003%。

2.4 Col-PC的理化性質(zhì)考察

2.4.1 DSC結(jié)果

DSC 結(jié)果見圖1。游離的Col 在157 ℃有一個強的吸熱峰，而制備成磷脂復(fù)合物這個吸熱峰不明顯，物理混合物在157 ℃左右也有一個小峰，但不是很強，有可能是磷脂和Col物理混合時，在加熱條件下產(chǎn)生自組裝。

圖1 DSC圖

2.4.2 表觀油水分配系數(shù)的測定

表觀油水分配系數(shù)P，見表4。以磷脂為載體，Col-PC的油水分配系數(shù)高于Col，將Col制備成磷脂復(fù)合物改善了Col的脂溶性。

表4 Col、Col-PC及物理混合物的表觀油水分配系數(shù)系數(shù)，n=3

2.4.3 體外細胞毒性試驗

Col和Col-PC給藥24 h后對不同腫瘤細胞的生長抑制情況，見圖2。對HSC-T6 細胞Col 的IC50為152.7 μg/mL，Col-PC為66.57 μg/mL，從IC50值來看，Col-PC的抑制效果優(yōu)于Col組。

圖2 秋水仙堿和Col-PC對HSC-T6的24 h的細胞生長抑制率

3 討論

目前，Col 現(xiàn)有的劑型在臨床上的應(yīng)用存在一定程度的限制。本研究以磷脂為載體，成功制備Col-PC，一定程度上提高了Col的油水分配系數(shù)，改善了Col 的脂溶性，實現(xiàn)高復(fù)合率，為制備Col 新劑型提供參考。本實驗的溫度設(shè)計是根據(jù)磷脂的特性進行設(shè)計的。磷脂在高于70 ℃條件下極易氧化[12]，故本實驗的溫度不超過60 ℃。再者，考慮磷脂置于室溫中容易氧化，穩(wěn)定性發(fā)生改變，因此，在復(fù)合物干燥時，選用冷凍干燥法。親脂性的增強，可能是由于藥物與磷脂的極性端發(fā)生相互作用，抑制該部分單鏈的自由轉(zhuǎn)動，而磷脂的脂肪酸長鏈等非極性部分并不參與復(fù)合反應(yīng)，可自由移動，包裹磷脂的極性部分形成一個親脂性表面，使復(fù)合物表現(xiàn)出較強的親脂性[13]。

經(jīng)MTT試驗結(jié)果顯示，Col及Col-PC都隨著藥物濃度的增加對HSC-T6 細胞的抑制率逐漸升高，呈濃度依賴性，在50 μg/mL、60 μg/mL 時抑制效果明顯，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但在其他濃度范圍差異無統(tǒng)計學(xué)意義。并且，Col-PC 在抑制HSC-T6 細胞較原料藥作用強，IC50值比原料藥低，能為擴寬Col的治療指數(shù)提供思路，為Col新劑型治療肝纖維化打下基礎(chǔ)。

本實驗僅對Col-PC的制備，部分理化性質(zhì)及對HSC-T6細胞的抑制作用進行研究，實驗尚未完全，以待進一步研究。有研究報道，磷脂復(fù)合物新型給藥系統(tǒng)可以抑制細胞膜上的P-gp蛋白的表達，阻斷藥物轉(zhuǎn)運，繼而提高療效[14]。且肝星狀細胞分泌CTGF、ECM 在肝星狀細胞中的互動是原代HCS 活化的中心通路[15]，這可能是Col-PC的藥效增強的原因。此外，我們課題組前期研究表明，秋水仙堿能抑制TGF-β1/Smad信號通路，減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化[16]，Col-PC的藥效機制還需進一步研究。