胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-27、E2F7的表達(dá)及臨床意義*

張武超,寇學(xué)斌△,許春進(jìn),舒閃閃

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬商丘市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科,河南商丘 476000；2.河南省商丘市婦幼保健院檢驗(yàn)科,河南商丘 476003

胰腺癌是高度惡性的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，全球每年發(fā)病人數(shù)達(dá)33.8萬(wàn)，死亡人數(shù)達(dá)33.1萬(wàn)，病死率極高，預(yù)后極差，5年總體生存率(OS)約為8%[1]。胰腺癌病理類型包括胰腺導(dǎo)管腺癌、腺鱗癌及多形性癌等。胰腺導(dǎo)管腺癌是最常見的病理類型，目前臨床上的治療方法有手術(shù)、化療及生物治療等，但胰腺癌患者早期無(wú)典型的臨床表現(xiàn)，一經(jīng)確診已為晚期，失去最佳的治療機(jī)會(huì)[2]。近年來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展，為胰腺導(dǎo)管腺癌的臨床診斷及治療提供新的方向。微小RNA(miR)是長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸的RNA分子，本身不具有編碼蛋白的功能，能與靶基因mRNA的3′非翻譯(UTR) 區(qū)結(jié)合，降低 mRNA的穩(wěn)定性，影響靶基因轉(zhuǎn)錄[3]。miR-27基因位于人類染色體19p13.12，研究發(fā)現(xiàn)，肝癌[4]、結(jié)直腸癌[5]等腫瘤中存在miR-27異常表達(dá)下調(diào)的現(xiàn)象，其作為一種抑癌基因，能夠抑制下游癌基因K-ras的表達(dá)，發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用,而其表達(dá)下調(diào)參與促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。E2F轉(zhuǎn)錄因子7(E2F7)編碼基因位于12q21.2，該基因編碼E2F7蛋白，屬于E2F轉(zhuǎn)錄因子家族成員，調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程。研究表明，E2F7在宮頸癌[6]、肝癌[7]等惡性腫瘤中發(fā)揮致癌基因的功能，其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞G1/S期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限增殖，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。范源等[8]研究表明，細(xì)胞中miR-27的表達(dá)下調(diào)伴隨著E2F7的上調(diào)，而敲低miR-27則促進(jìn)E2F7的表達(dá)，因而miR-27和E2F7可能存在負(fù)反饋回路，影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本研究通過(guò)研究miR-27和E2F7在胰腺導(dǎo)管腺癌中的表達(dá)，探討miR-27和E2F7的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年1月至2019年1月在在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬商丘市第一人民醫(yī)院診治的93例胰腺導(dǎo)管腺癌患者的資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)病理學(xué)檢查確診為胰腺導(dǎo)管腺癌；(2)初次診治，無(wú)化療、放療病史；(3)患者能夠配合隨訪，隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并胃腸道感染性疾??；(2)有其他惡性腫瘤病史；(3)合并心、肺、腎等臟器功能障礙。93例胰腺導(dǎo)管腺癌患者中男52例，女41例；年齡38～75歲，平均(51.23±6.1)歲，≤60歲40例，>60歲53例；腫瘤分期：Ⅰ期34例，Ⅱ～Ⅲ期59例；病理分級(jí)：高分化30例，中低分化63例；腫瘤最大徑：≤2 cm 52例，>2 cm 41例；腫瘤位置：胰頭51例，胰體、胰尾42例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移49例。所有患者自確診之日起開始隨訪，以電話方式隨訪，每個(gè)月進(jìn)行一次隨訪，隨訪內(nèi)容為患者生存情況，隨訪時(shí)間截止至2020年2月，隨訪終點(diǎn)為患者死亡或隨訪結(jié)束。本研究經(jīng)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬商丘市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)檢測(cè)miR-27、E2F7基因的表達(dá) 收集新鮮獲取(術(shù)中獲取標(biāo)本，標(biāo)本離體30 min以內(nèi))的癌組織及癌旁組織(距離癌組織邊緣0.5 cm以上)，-80 ℃保存。應(yīng)用Trizol提取癌組織及癌旁組織中的RNA，Narodrop檢測(cè)RNA水平。以組織中RNA為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，形成cDNA，進(jìn)行qPCR檢測(cè)。miR-27引物正向序列：5′-TGGTGGCAGTAGAGGCTATG-3′，反向序列：5′-AGTCCAGGCCAGTATGTTAC-3′；內(nèi)參U6正向序列:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向序列:3′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-5′。E2F7正向序列:5′-AATGCAGTGGTTGTTTCTGT-3′，反向序列:5′-TGCCATTGCTTCTTCACTAC-3′；內(nèi)參GAPDH正向序列:5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，反向序列:5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。總體系20 μL：cDNA 1 μL，Taq聚合酶0.2 μL、上下游引物各1 μL、SYBR Greenpremix 10 μL及1 μL濃度為20 mmol/L的dNTPs，DEPC水5.8 μL。qPCR反應(yīng)條件：50 ℃活化2 min，95 ℃ 預(yù)變性2 min，95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 退火32 s，70 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-27、E2F7 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.2免疫印跡檢測(cè)組織中E2F7蛋白表達(dá) 將50 mg的癌組織及癌旁組織冰上研磨，加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液，裂解0.5 h，提取組織蛋白。蛋白BCA法定量后，加SDS上樣緩沖液，95 ℃金屬浴煮樣10 min。SDS-PAGE 膠電泳：濃縮膠恒壓80 V，分離膠恒壓130 V，然后進(jìn)行濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，恒流250 mA轉(zhuǎn)印90 min。將PVDF 膜放入5%脫脂奶中封閉2 h，TBST洗3遍，每次5 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜(E2F7單克隆抗體購(gòu)自Abcam，貨號(hào)：56022)，二抗室溫孵育1 h。ECL暗室顯影照相。

2 結(jié) 果

2.1組織中miR-27、E2F7的表達(dá) 癌組織中miR-27的相對(duì)表達(dá)水平為0.425±0.081，在癌旁組織中為1.370±0.225，癌組織中miR-27的相對(duì)表達(dá)水平明顯低于癌旁組織(t=38.109，P<0.001)；癌組織中E2F7基因的相對(duì)表達(dá)水平為1.755±0.306，在癌旁組織中為0.317±0.094，癌組織中E2F7基因的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于癌旁組織(t=43.321，P<0.001)，見圖1A。免疫印跡結(jié)果顯示，E2F7蛋白在癌組織和癌旁組織中的相對(duì)灰度值分別為2.147±0.421、0.308±0.019，癌組織中E2F7蛋白相對(duì)灰度值明顯高于癌旁組織(t=42.082,P<0.001)。見圖1B。以癌組織中miR-27相對(duì)表達(dá)水平的均值0.425為界，miR-27高表達(dá)組45例，miR-27低表達(dá)組48例；以癌組織中E2F7基因相對(duì)表達(dá)水平的均值1.755為界，E2F7基因高表達(dá)組44例，E2F7基因低表達(dá)組49例。

2.2癌組織中miR-27、E2F7基因的表達(dá)的相關(guān)性及相互作用預(yù)測(cè) Pearson線性相關(guān)分析結(jié)果，癌組織中miR-27與E2F7基因的相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.612，P<0.001)，見圖2。采用TargetScan Human7.2在線軟件(http://www.targetscan.org/vert_72/)預(yù)測(cè)miR-27與E2F7基因的結(jié)合位點(diǎn)，結(jié)果顯示E2F7基因的3′非編碼區(qū)第788～795個(gè)堿基存在與miR-27相互作用的位點(diǎn)，見圖3。

注：A表示癌組織與癌旁組織中miR-27與E2F7 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較；B表示癌組織與癌旁組織E2F7蛋白表達(dá)比較。N1為病例1癌旁組織，C1為病例1癌組織；N2病例2癌旁組織，C2為病例2癌組織。

圖2 癌組織中miR-27與E2F7基因表達(dá)的相關(guān)性

圖3 生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測(cè)miR-27與 E2F7基因的結(jié)合位點(diǎn)

2.3癌組織中miR-27、E2F7基因的相對(duì)表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系 不同腫瘤TNM分期、有或無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胰腺導(dǎo)管腺癌患者癌組織中miR-27與E2F7基因相對(duì)表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而不同性別、年齡、病理分級(jí)、腫瘤最大徑、腫瘤位置的患者癌組織中miR-27與E2F7基因相對(duì)表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅱ～Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中miR-27的相對(duì)表達(dá)水平均明顯低于Ⅰ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)；Ⅱ～Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中E2F7基因相對(duì)表達(dá)水平均明顯高于Ⅰ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者(P<0.05)，見表1。

表1 癌組織中miR-27、E2F7基因相對(duì)表達(dá)水平與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.4癌組織中miR-27與E2F7基因的不同表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 所有患者出院后隨訪2～12個(gè)月，中位隨訪時(shí)間7個(gè)月，隨訪結(jié)束時(shí)死亡62例，1年OS為33.3%(31/93)。miR-27高表達(dá)組及低表達(dá)組患者的1年OS分別為51.1%(23/45)、16.7%(8/48)，miR-27低表達(dá)組患者1年OS明顯低于高表達(dá)組患者(χ2=5.129，P=0.015)。E2F7基因高表達(dá)組及低表達(dá)組患者的1年OS分別為13.6%(6/44)、51.0%(25/49)，E2F7基因高表達(dá)組患者1年OS明顯低于低表達(dá)組患者(χ2=6.514，P=0.002)，見圖4。

圖4 miR-27、E2F7基因不同表達(dá)患者的預(yù)后比較

3 討 論

目前胰腺導(dǎo)管腺癌的病死率高，該病病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚[9]。目前認(rèn)為，遺傳因素、環(huán)境因素等引起的分子遺傳學(xué)改變是胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，大量癌基因的激活或(和)抑癌基因的失活，促進(jìn)了腫瘤的惡性進(jìn)展[10]。深入探討胰腺導(dǎo)管腺癌發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，對(duì)于尋找新的診斷治療方案具有重要的臨床價(jià)值。

miR-27基因位于人類19號(hào)染色體。研究表明，腫瘤中miR-27作為一種抑癌基因，miR-27的表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)了癌基因ATG10的表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤的惡性增殖及轉(zhuǎn)化[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，癌組織中miR-27的表達(dá)水平下調(diào)，其機(jī)制尚不清楚，可能與長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)對(duì)miR-27的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。LI等[12]研究表明，LncRNA SNAI3-AS1本身可作為分子支架結(jié)合miR-27分子，同時(shí)抑制miR-27基因的表達(dá)，導(dǎo)致下游癌基因PEG10表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，Ⅱ～Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中miR-27表達(dá)較低，表明miR-27的低表達(dá)促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的惡性進(jìn)展。其機(jī)制可能與miR-27的抑癌基因功能有關(guān)。YILMAZ等[13]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，miR-27能夠結(jié)合腫瘤中重要的癌基因K-ras mRNA的3′UTR區(qū)，抑制K-ras的表達(dá)，miR-27表達(dá)水平的降低導(dǎo)致K-ras過(guò)度激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖，導(dǎo)致腫瘤分期升高。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是miR-27的直接作用靶點(diǎn)，腫瘤中miR-27的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)VEGF的分泌，促進(jìn)腫瘤血管及淋巴管的生成，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[14]。本研究中miR-27低表達(dá)組患者的1年OS較低，表明胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-27的低表達(dá)與患者的不良預(yù)后關(guān)系密切，有望成為判斷患者預(yù)后的分子指標(biāo)。

轉(zhuǎn)錄因子E2F7是促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素，參與調(diào)控細(xì)胞周期、腫瘤血管生成和DNA的損傷修復(fù)等生理學(xué)過(guò)程。E2F7屬于非典型E2F因子家族成員，包含兩個(gè)單獨(dú)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過(guò)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶標(biāo)的啟動(dòng)子位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)[15]。有研究表明，E2F7作為一種癌基因，在胃癌、肝癌和頭頸部癌等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并通過(guò)激活c-myc等基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的增殖[16]。本研究表明，胰腺導(dǎo)管腺癌組織中E2F7的表達(dá)升高，可能與E2F7轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控異常有關(guān)。XU 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，E2F7受到miR-10b的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控，miR-10b能夠結(jié)合E2F7的mRNA，降低E2F7mRNA的穩(wěn)定性，抑制E2F7的表達(dá)，而腫瘤發(fā)生時(shí)miR-10b的表達(dá)水平降低，導(dǎo)致E2F7 的表達(dá)上調(diào)。本研究中，E2F7基因的表達(dá)與較高的腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明E2F7的高表達(dá)促進(jìn)胰腺導(dǎo)管腺癌的惡性進(jìn)展。其原因可能與E2F7對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的調(diào)控有關(guān)。有研究表明，E2F7的表達(dá)上調(diào)能夠通過(guò)抑制P53基因介導(dǎo)的凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路的傳導(dǎo)，抑制腫瘤凋亡，促進(jìn)腫瘤惡性增殖，導(dǎo)致分期升高[18]。研究表明，E2F7的水平升高能夠降低細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定性，抑制與基因組穩(wěn)定性有關(guān)的基因(如53BP1)的表達(dá)，導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)障礙，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展[19]。本研究中，E2F7基因高表達(dá)的胰腺導(dǎo)管腺癌患者1年OS較低，表明E2F7基因的高表達(dá)能反映患者的不良預(yù)后。 此外，癌組織中miR-27與E2F7基因的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，本研究同時(shí)采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，結(jié)果兩者存在潛在的結(jié)合位點(diǎn)，提示E2F7基因可能受到miR-27的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控。目前胰腺導(dǎo)管腺癌中兩者間的相互作用機(jī)制尚不明確，有學(xué)者在成肌細(xì)胞發(fā)現(xiàn)miR-27能夠結(jié)合并抑制E2F7的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖[8]。

綜上所述，胰腺導(dǎo)管腺癌組織中miR-27表達(dá)降低，E2F7基因和蛋白表達(dá)升高，miR-27與E2F7基因表達(dá)呈明顯負(fù)相關(guān)，且miR-27、E2F7基因的表達(dá)與胰腺導(dǎo)管腺癌患者的腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，癌組織中miR-27低表達(dá)及E2F7基因高表達(dá)的患者預(yù)后較差，兩者有望成為新的胰腺導(dǎo)管腺癌分子標(biāo)志物，但兩者的作用機(jī)制及臨床價(jià)值有待深入研究。