NSCLC癌組織中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性

馮海玲，范長(zhǎng)玲，潘中軍，何圣科，張 敏

海南省儋州市人民醫(yī)院：1.病理科；2.檢驗(yàn)科,海南儋州 571700

非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是臨床較為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，流行病學(xué)調(diào)查顯示，NSCLC約占肺癌總數(shù)的80%[1]。NSCLC發(fā)病早期均無(wú)明顯的癥狀，大多數(shù)患者發(fā)病時(shí)已為晚期，喪失了手術(shù)治療的絕佳時(shí)機(jī)[2]。所以，在臨床治療中，通過(guò)對(duì)患者臨床標(biāo)志物的分析進(jìn)行臨床輔助診斷已經(jīng)成為目前研究的熱點(diǎn)。雙腎上腺素樣激酶 1(DCLK1)是神經(jīng)元細(xì)胞有絲分裂的重要微管相關(guān)激酶[3]，有研究顯示，DCLK1可通過(guò)對(duì)NSCLC患者的微小RNA(miRNA)-144水平的顯著性抑制，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)化，對(duì)腫瘤的進(jìn)展具有重要作用[4]。GLI家族鋅指蛋白3(GLI3)可通過(guò)對(duì)NSCLC癌細(xì)胞的增殖以及凋亡的調(diào)控，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[5]。半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)是腫瘤細(xì)胞凋亡途徑中最為重要的執(zhí)行因子，通過(guò)對(duì)上游信號(hào)的顯著性激活，引發(fā)局部級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡[6]。本研究主要通過(guò)對(duì)NSCLC癌組織中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性分析，為NSCLC的臨床診斷以及預(yù)后評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年2月至2017年3月本院診斷的NSCLC患者60例作為研究對(duì)象，其中男36例，女24例;年齡59～77歲，平均(64.24±2.09)歲；平均體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為(24.66±2.11)kg/m2；病程4～11年，平均(6.44±2.39)年；TNM分期：ⅢA期11例、ⅢB期37例、Ⅳ期12例；病理類(lèi)型：腺癌32例，鱗癌28例；腫瘤位置：中央型32例，周?chē)?8例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者均符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(2)預(yù)計(jì)生存時(shí)間>6個(gè)月；(3)心電圖無(wú)異常；(4)腫瘤大小均可經(jīng)CT進(jìn)行測(cè)量；(5)患者卡氏評(píng)分≥70分，身體可耐受化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)診斷或合并小細(xì)胞肺癌者；(2)治療過(guò)程中出現(xiàn)嚴(yán)重中性粒細(xì)胞降低、神經(jīng)毒性以及外周神經(jīng)炎患者；(3)有嚴(yán)重精神障礙無(wú)法配合者；(4)有嚴(yán)重心臟、肝、腎功能障礙的患者；(5)對(duì)本研究藥物過(guò)敏或者不耐受患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2方法 所有患者均進(jìn)行肺部活檢，取患者的癌組織以及癌旁組織，采用石蠟包埋后進(jìn)行連續(xù)切片，切片的厚度設(shè)定為4 μm，采用pH6.0的檸檬酸修復(fù)液對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟以及脫水，采用高壓加熱法對(duì)抗原進(jìn)行修復(fù)。分別采用1∶100的DCLK1、Caspase-3和GLI3抗體進(jìn)行滴加，在4 ℃下孵育過(guò)夜，采用多聚物酶標(biāo)二抗進(jìn)行滴加后，在37 ℃下繼續(xù)孵育45 min，采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)進(jìn)行顯色，蘇木精進(jìn)行復(fù)染。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒物即為DCLK1、Caspase-3和GLI3陽(yáng)性。采用染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞的二級(jí)計(jì)數(shù)法對(duì)DCLK1、Caspase-3和GLI3進(jìn)行評(píng)分，無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，黃褐色為2分，深褐色為3分。陽(yáng)性細(xì)胞比例<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～100%為3分。將染色強(qiáng)度以及染色比例的評(píng)分乘積作為以上蛋白表達(dá)程度的評(píng)價(jià)依據(jù)，6分以下為低表達(dá)，6分及6分以上為高表達(dá)[8]。比較癌組織以及癌旁組織DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況的差異；比較不同病理狀態(tài)、不同預(yù)后的患者癌組織DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況的差異。分別對(duì)癌組織的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后之間的相關(guān)性進(jìn)行分析。所有患者均進(jìn)行安羅替尼靶向治療3個(gè)月，且對(duì)所有患者展開(kāi)為期3年的隨訪，以死亡作為終點(diǎn)事件，將其分為死亡組和生存組。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1癌組織及癌旁組織的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況比較 癌組織的Caspase-3和GLI3蛋白高表達(dá)比例顯著高于癌旁組織，DCLK1蛋白的高表達(dá)比例顯著低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 癌組織以及癌旁組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況比較[ n(%)]

2.2不同臨床特征患者癌組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況比較 不同性別、年齡、TNM分期患者癌組織中DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況之間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；腺癌患者癌組織中的Caspase-3和GLI3蛋白高表達(dá)比例顯著高于鱗癌患者，DCLK1蛋白高表達(dá)比例顯著低于鱗癌患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者癌組織中的Caspase-3和GLI3蛋白高表達(dá)比例顯著高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，DCLK1蛋白高表達(dá)比例顯著低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同臨床特征患者癌組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況比較[ n(%)]

2.3不同預(yù)后患者癌組織中的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況比較 至隨訪結(jié)束，死亡組20例，生存組40例。死亡組癌患者癌組織中的Caspase-3和GLI3蛋白高表達(dá)比例顯著高于生存組，DCLK1蛋白高表達(dá)比例顯著低于生存組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后患者癌組織的DCLK1、Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況比較[ n(%)]

2.4相關(guān)性分析 NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后分別與癌組織中Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況呈正相關(guān)(P<0.05)，與DCLK1蛋白表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 相關(guān)性分析

3 討 論

NSCLC是臨床發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一[9]，疾病的早期臨床癥狀不明顯，加之早期診斷能力有限，多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期，喪失了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)。所以在疾病的早期，通過(guò)對(duì)NSCLC患者生化指標(biāo)的分析來(lái)進(jìn)行臨床輔助診斷對(duì)于疾病的診治具有重要意義[10]。

在早期的研究中，DCLK1主要參與神經(jīng)元細(xì)胞的逆行運(yùn)輸以及遷移，同時(shí)在一定程度上還參與了神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡。有研究報(bào)道，在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，DCLK1可通過(guò)與微管細(xì)胞的顯著性結(jié)合作用[11]，共同形成細(xì)胞骨架，同時(shí)在細(xì)胞的細(xì)胞周期以及分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用。目前已經(jīng)證實(shí)，DCLK1在胃癌、胰腺癌、結(jié)腸癌以及肝癌中呈顯著高表達(dá)[12]。本研究對(duì)不同預(yù)后以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者的DCLK1蛋白表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，隨著患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生以及不良預(yù)后的發(fā)展，患者的DCLK1水平顯著下降。周美玲等[13]的研究報(bào)道，DCLK1與NSCLC腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。隨著疾病的進(jìn)展，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的破壞能力增強(qiáng)，正常細(xì)胞的骨架被顯著破壞，因此患者的DCLK1水平顯著下降。

GLI3蛋白是通路轉(zhuǎn)錄因子蛋白中的重要分子，在Hh信號(hào)通路中具有重要作用。在Hh信號(hào)通路中，GLI3蛋白通過(guò)對(duì)NSCLC腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡以及耐藥情況的介導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行氯化鉀抑制糖原合成酶激酶的作用，進(jìn)一步促進(jìn)GLI3蛋白的加工合成能力，在一定程度上促進(jìn)了直腸癌的進(jìn)展[14]。陳盈盈等[15]通過(guò)對(duì)NSCLC患者GLI3蛋白水平的分析發(fā)現(xiàn)，隨著患者的疾病進(jìn)展，患者的GLI3蛋白水平顯著升高，提示在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過(guò)程中，GLI3蛋白還可通過(guò)血行播散等方式促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。

在NSCLC的病程中，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)正常細(xì)胞的顯著性破壞作用，局部組織的炎性反應(yīng)加重，而Caspase-3主要是在Nod樣受體家族pyrin結(jié)構(gòu)域蛋白3(NLRP3)的C末端進(jìn)行胱天蛋白募集以及在熱蛋白結(jié)構(gòu)域的作用下形成，在此形成過(guò)程中，由于炎性反應(yīng)被顯著激活，局部炎性反應(yīng)水平呈級(jí)聯(lián)式增長(zhǎng)，進(jìn)一步造成正常細(xì)胞的凋亡。肖麗娜等[16]在對(duì)NSCLC患者Caspase-3表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞凋亡情況的分析中發(fā)現(xiàn)，患者的Caspase-3水平與腫瘤細(xì)胞的凋亡呈正相關(guān)。

綜上所述，NSCLC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及不良預(yù)后分別與癌組織中Caspase-3和GLI3蛋白表達(dá)情況呈正相關(guān)，與DCLK1蛋白表達(dá)情況呈負(fù)相關(guān)，可為日后臨床診斷提供依據(jù)。但本研究也存在一定的局限性，如樣本量較小，所選取的患者均為中晚期患者等，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。